羅 曦， 吳方喜， 謝鴻光， 朱永生， 張建福*， 謝華安*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/農(nóng)業(yè)部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福州國(guó)家水稻改良分中心/

福建省作物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室/福建省水稻分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350003

2. 福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 福建 福州 350003

3. 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南基地， 福建 福州 350003

4. 水稻國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350003

近紅外光譜的水稻抗性淀粉含量測(cè)定研究

羅 曦1，2，3，4， 吳方喜1，2，3，4， 謝鴻光1，2，3，4， 朱永生1，2，3，4， 張建福1，2，3，4*， 謝華安1，2，3，4*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/農(nóng)業(yè)部華南雜交水稻種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福州國(guó)家水稻改良分中心/

福建省作物分子育種工程實(shí)驗(yàn)室/福建省水稻分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350003

2. 福建省作物種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 福建 福州 350003

3. 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華南基地， 福建 福州 350003

4. 水稻國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350003

用化學(xué)法測(cè)定水稻抗性淀粉含量耗時(shí)長(zhǎng)、 成本高， 為此， 探索了基于近紅外光譜技術(shù)(NIRS)的水稻抗性淀粉含量測(cè)定新途徑。 首先， 采集了62份抗性淀粉含量差異較大的水稻的光譜數(shù)據(jù)， 將光譜數(shù)據(jù)和已測(cè)定的化學(xué)值數(shù)據(jù)導(dǎo)入化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件， 采用偏最小二乘法(PLS)建立了抗性淀粉含量的近紅外定標(biāo)模型， 對(duì)不同預(yù)處理得到的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行了內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證。 結(jié)果如下： 內(nèi)部交叉驗(yàn)證方面， 未處理、 MSC+1thD預(yù)處理、 1thD +SNV預(yù)處理的決定系數(shù)(R2)分別為0.920 2， 0.967 0， 0.976 7， 預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)分別為1.533 7， 1.011 2， 0.837 1。 外部驗(yàn)證方面， 未處理、 MSC+1thD預(yù)處理和1thD +SNV預(yù)處理的決定系數(shù)(R2)分別為0.805， 0.976， 0.992， 絕對(duì)誤差平均值分別為1.456， 0.818， 0.515， 預(yù)測(cè)值和化學(xué)值之間沒(méi)有顯著差異(Turkey法多重比較)， 說(shuō)明以近紅外光譜分析法代替化學(xué)測(cè)定法是有可能的。 在不同預(yù)處理方法之中， 1thD+SNV的預(yù)處理方法無(wú)論內(nèi)部驗(yàn)證還是外部驗(yàn)證都具有較高的決定系數(shù)和較低的誤差值， 定標(biāo)模型精度更高， 誤差更小。

水稻； 抗性淀粉； 近紅外光譜； 定標(biāo)模型； 含量檢測(cè)

引 言

抗性淀粉(resistant starch， RS)是指在健康者小腸中不被吸收的淀粉及其降解產(chǎn)物[1]。 抗性淀粉具有降低糖尿病患者飯后血糖值[2]、 減少腸機(jī)能失調(diào)及結(jié)腸癌發(fā)病率[3]等重要的生理功能。 抗性淀粉是近年來(lái)功能食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 而水稻作為世界一半以上人口的主食， 適當(dāng)增加其中的抗性淀粉含量對(duì)人們的健康有重要的意義。

我國(guó)相關(guān)研究單位在水稻高抗性淀粉育種方面的研究工作比較少， 阻礙其發(fā)展的主要難點(diǎn)在于抗性淀粉的測(cè)定難度比較大， 成本高、 測(cè)定周期長(zhǎng)、 試驗(yàn)步驟繁瑣。 在育種過(guò)程中， 雜交后代群體數(shù)量龐大， 每一代群體都需要篩選出具有目的性狀的單株， 除了在育種策略上需要簡(jiǎn)化篩選方法外， 從根本上說(shuō)， 還亟需一種高效的、 穩(wěn)定的測(cè)定方法。

近紅外光譜(near-infrared reflectance spectroscopy， NIRS)分析技術(shù)綠色環(huán)保的物理測(cè)試技術(shù)， 已成功應(yīng)用于食品、 藥物、 煙草、 飼料等諸多行業(yè)產(chǎn)品的分析測(cè)定[4]， 特別是在農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)分析上， 因其快速、 無(wú)需前期處理、 非破壞性、 低成本以及多組分同時(shí)定量分析測(cè)試等特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。 目前， 水稻的大部分的品質(zhì)(蒸煮品質(zhì)、 營(yíng)養(yǎng)品質(zhì))性狀都有應(yīng)用近紅外技術(shù)來(lái)測(cè)定成分含量的研究報(bào)道， 例如直鏈淀粉含量[5]、 膠稠度[6]、 氨基酸含量[7]和脂肪含量[8]等。 但是， 基于近紅外技術(shù)對(duì)水稻抗性淀粉含量進(jìn)行測(cè)定的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。 為此， 用62份抗性淀粉含量差異較大的水稻材料， 構(gòu)建了水稻抗性淀粉含量的近紅外預(yù)測(cè)模型， 對(duì)不同預(yù)處理下得到的預(yù)測(cè)模型進(jìn)行了內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證， 探討了不同模型的預(yù)測(cè)效果， 以期為水稻抗性淀粉育種的后代篩選提供快速、 穩(wěn)定的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)室保存的水稻親本材料17份(其中秈稻12份， 粳稻5份)， 抗性淀粉含量差異顯著的2個(gè)水稻材料功米3號(hào)與9311雜交組合的F2群體48份， 共65份。 每份材料取10～20 g稻谷， 脫殼后將糙米打磨成精米， 用粉碎機(jī)(北京， 興時(shí)利和公司產(chǎn)， ZN-02小型高速粉碎機(jī))把精米打磨成細(xì)粉， 過(guò)100目篩， 統(tǒng)一烘干處理后含水量為12%左右， 待測(cè)。

1.2 抗性淀粉含量的測(cè)定

抗性淀粉含量的測(cè)定參考羅曦等[9]， 每份樣品3次重復(fù)。

1.3 光譜采集

用DA7200 二極管陣列分析儀(瑞典波通儀器公司)采集樣品的光譜數(shù)據(jù)， 波長(zhǎng)范圍： 950～1 650 nm， 分辨率： 2 nm。 將準(zhǔn)備好的米粉過(guò)量加入樣品杯中。 用直邊的工具， 如尺子， 將多出的部分刮去。 樣品杯應(yīng)該一直是加滿的并保持平整的表面， 將樣品杯(盛有樣品)放到圓形托架上， 點(diǎn)擊“采集”按鈕開(kāi)始采集， 每個(gè)樣品重復(fù)裝樣3次， 數(shù)據(jù)輸出時(shí)， 自動(dòng)取其平均值。

1.4 光譜數(shù)據(jù)的輸出以及校正集與驗(yàn)證集的劃分

用DA7200自帶的光譜分析軟件Simplicity將采集到的原始光譜數(shù)據(jù)與化學(xué)值數(shù)據(jù)合并， 同時(shí)設(shè)置馬氏距離闕值為3.0， 軟件自動(dòng)刪除了3個(gè)異常樣品(樣品數(shù)剩下62個(gè))， 并輸出合并后的數(shù)據(jù)文件。 接下來(lái)， 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件Unscrambler9.7(CAMO公司， 美國(guó))， 然后將62份樣品從小到大排列， 每5個(gè)樣品中選出1個(gè)樣品作為外部驗(yàn)證樣品集， 共選出12個(gè)樣品， 剩余50個(gè)樣品作為校正集樣品。

1.5 預(yù)測(cè)模型的建立

對(duì)50份校正集的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行兩種不同的預(yù)處理： (1)Savitzky Golay法一階求導(dǎo)+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation, SNV)以下簡(jiǎn)寫(xiě)為1thD+SNV。 (2)多元散射校正(multiplicative scatter correction, MSC)+Savitzky Golay法一階求導(dǎo)， 以下簡(jiǎn)寫(xiě)為MSC+1thD， 用偏最小二乘法(partial least squares, PLS)建立不同預(yù)處理后的定標(biāo)模型。 最大主成分?jǐn)?shù)(principal components, PCs)設(shè)為10。

1.6 預(yù)測(cè)模型的評(píng)價(jià)和驗(yàn)證

用決定系數(shù)R2和均方根誤差RMSE這兩個(gè)參數(shù)作為評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型效果的主要指標(biāo)， 一個(gè)好的預(yù)測(cè)模型應(yīng)具有較高的決定系數(shù)R2， 較低的均方根誤差RMSE。 用內(nèi)部交叉驗(yàn)證(internal cross-validation)驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度， 用外部驗(yàn)證(external validation)進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)值和化學(xué)值之間的符合程度。

2 結(jié)果與討論

2.1 校正集與驗(yàn)證集的統(tǒng)計(jì)分析

從表1可知， 驗(yàn)證集的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值比校正集的標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值要大， 說(shuō)明前者的抗性淀粉含量變幅稍寬。 校正集和驗(yàn)證集的變異系數(shù)都很大， 說(shuō)明用于近紅外建模的校正集樣品多態(tài)性比較豐富， 而驗(yàn)證集的分布也在合理范圍之內(nèi)。 另外， 校正集樣品數(shù)已達(dá)到構(gòu)建水稻抗性淀粉近紅外基礎(chǔ)模型的要求。

Table 1 Distribution of RS content about

Fig.1 Contrast of spectral curve before and after pretreatment

2.2 預(yù)處理前后的光譜曲線對(duì)比

圖1(a)是未經(jīng)過(guò)預(yù)處理的光譜曲線圖， 在1 465 nm附近達(dá)到峰值隨后下降。 圖1(b)和(c)分別是MSC+1thD處理和1thD +SNV處理的光譜曲線圖， 總的來(lái)說(shuō)， 這兩種預(yù)處理后的曲線圖都在1 150和1 415 nm波長(zhǎng)處有比較明顯的“吸收峰” ， 而MSC+1thD處理光譜吸收值較未處理的光譜吸收值范圍變窄， 1thD +SNV處理的光譜吸收值范圍變寬。 兩種預(yù)處理都使光譜曲線的“峰谷”特征更加明顯。

2.3 不同預(yù)處理的校正和內(nèi)部檢驗(yàn)

表2是三種預(yù)處理的建模結(jié)果， 從校正集的結(jié)果來(lái)看， 三種處理的相關(guān)系數(shù)都具有較好的線性關(guān)系， MSC+1thD處理和1thD+SNV處理的決定系數(shù)(R2)相近似， 而且都比未處理的決定系數(shù)(R2)要高。 從誤差方面來(lái)看， 三種預(yù)處理的校正均方根誤差(RMSEC)、 校正標(biāo)準(zhǔn)誤(SEC)的數(shù)值表現(xiàn)為： 未處理>MSC+1thD處理>1thD +SNV處理； 從內(nèi)部交叉驗(yàn)證結(jié)果來(lái)看， 三種預(yù)處理的相關(guān)系數(shù)、 決定系數(shù)(R2)與校正集相比有所降低， 決定系數(shù)(R2)表現(xiàn)為： 未處理MSC+1thD處理>1thD +SNV處理。 總的來(lái)看， 經(jīng)過(guò)兩種不同的預(yù)處理方法的建模效果都比未處理的建模效果好， 提高了模型的精度。 而1thD+SNV處理與MSC+1thD處理相比， 前者的決定系數(shù)更高， 誤差更小。 在建模的過(guò)程中， 主成分因子數(shù)的選取十分重要。 如果建模時(shí)主成分因子數(shù)選擇過(guò)少， 光譜中一些有用的信息可能被忽略， 影響模型的預(yù)測(cè)能力； 相反， 如果選擇的主成分因子數(shù)過(guò)多， 則會(huì)將一些噪聲成分加到模型中， 模型的準(zhǔn)確度就會(huì)降低[10]。 本研究的最大主成分?jǐn)?shù)設(shè)置為10， 也就是說(shuō)， 通過(guò)內(nèi)部交叉驗(yàn)證確定的最佳主成分?jǐn)?shù)(Optimal of PCs)小于10。 從內(nèi)部交叉驗(yàn)證結(jié)果可知， 內(nèi)部驗(yàn)證的兩種預(yù)處理的最佳主成分?jǐn)?shù)(Optimal of PCs)為5， 而未處理為6， 相對(duì)最大主成分?jǐn)?shù)10來(lái)說(shuō)偏高， 而且內(nèi)部驗(yàn)證的預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)也相對(duì)較高， 所以需要通過(guò)外部驗(yàn)證來(lái)進(jìn)一步確定模型的準(zhǔn)確度。

Table 2 Result for NIR spectroscopy Model by using different pretreatments

2.4 不同預(yù)處理定標(biāo)模型的外部檢驗(yàn)

選取抗性淀粉含量變幅平均分布于總樣品集的12份樣品用于近紅外模型的外部驗(yàn)證。 表3、 圖2是三種預(yù)處理近紅外建模的外部檢驗(yàn)結(jié)果， 結(jié)果表明， 未處理、 MSC+1thD處理和1thD+SNV處理預(yù)測(cè)值和化學(xué)測(cè)定值的決定系數(shù)(R2)分別為0.805， 0.976， 0.992， 絕對(duì)誤差平均值分別為1.456， 0.818， 0.515， 偏差平均值方面， 未處理和MSC+1thD處理的偏差平均值相近， 且大于1thD+SNV處理。 總的來(lái)說(shuō)， 三種處理的預(yù)測(cè)值與化學(xué)值沒(méi)有顯著差異(Turkey法多重比較)， 而1thD +SNV處理的決定系數(shù)(R2)最高， 絕對(duì)誤差平均值、 偏差平均值最小， 說(shuō)明經(jīng)過(guò)該預(yù)處理的抗性淀粉近紅外預(yù)測(cè)模型在精確度和準(zhǔn)確度方面相對(duì)較好。 從單個(gè)樣品來(lái)看Sample#_7， Sample#_12， Sample#_11的預(yù)測(cè)值與化學(xué)值的絕對(duì)誤差值相對(duì)較高， 而這三個(gè)樣本均屬于17

Table 3 Predicted results by using different pretreatments

Note： Capital letters indicate the significant differences atp=0.01 compared to chemical reference and the lowercase letters indicate the significant differences atp=0.05

Fig.2 Result of external-validation by using different pretreatments

份水稻親本材料之中， 其中Sample#_7和Sample#_12是秈稻品種， Sample#_11屬于北方粳稻品種。 用于建模的50份材料中大部分是高抗性淀粉含量材料功米3號(hào)與低抗性淀粉含量品種9311的F2群體， 所以， 得到的定標(biāo)模型在預(yù)測(cè)范圍上存在著一定的局限性， 對(duì)于遺傳背景與上述F2群體遺傳差異較大水稻材料預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度較差。

3 結(jié) 論

對(duì)兩種不同預(yù)處理下的校正集進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證和外部檢驗(yàn)得到以下結(jié)論： (1)兩種預(yù)處理的檢驗(yàn)結(jié)果都比對(duì)照要好。 (2)內(nèi)部交叉驗(yàn)證方面， 1thD+SNV預(yù)處理的(R2)為0.976 7， 預(yù)測(cè)均方根誤差為0.837 1。 (3)外部驗(yàn)證方面， 預(yù)處理1thD+SNV的(R2)為0.992， 平均偏差為0.602。 (4)總的來(lái)看， 經(jīng)過(guò)1thD+SNV預(yù)處理的定標(biāo)模型的效果最好。 綜上所述， 對(duì)水稻抗性淀粉含量近紅外定標(biāo)模型驗(yàn)證結(jié)果比較理想。 但是， 研究樣品大部分是水稻F2群體， 其遺傳背景較小， 而水稻中抗性淀粉分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜[11]， 所以本模型是否對(duì)所有的水稻品種都有較好的預(yù)測(cè)效果有待驗(yàn)證。 本研究樣本數(shù)量較少， 但是符合構(gòu)建近紅外預(yù)測(cè)模型的基本要求。 隨著研究的進(jìn)一步深入， 更多的不同遺傳特點(diǎn)的水稻材料的光譜數(shù)據(jù)會(huì)加入到該模型中， 使其預(yù)測(cè)范圍更加廣泛， 預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性可望進(jìn)一步提高。

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*Corresponding authors

Research on Resistant Starch Content of Rice Grain Based on NIR Spectroscopy Model

LUO Xi1,2,3,4, WU Fang-xi1,2,3,4, XIE Hong-guang1,2,3,4, ZHU Yong-sheng1,2,3,4, ZHANG Jian-fu1,2,3,4*， XIE Hua-an1,2,3,4*

1. Rice Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Germplasm Innovation and Molecular Breeding of Hybrid Rice for South China, Ministry of Agriculture/Fuzhou Branch, National Rice Improvement Center of China/Fujian Engineering Laboratory of Crop Molecular Breeding/ Fujian Key Laboratory of Rice Molecular Breeding, Fuzhou 350003， China

2. Incubator of National Key Laboratory of Fujian Crop Germplasm Innovation and Molecular Breeding between Fujian and Ministry of Sciences and Technology， Fuzhou 350003， China

3. South-China Base of National Key Laboratory of Hybrid Rice of China, Fuzhou 350003， China

4. National Engineering Laboratory of Rice, Fuzhou 350003， China

A new method based on near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS) analysis was explored to determine the content of rice-resistant starch instead of common chemical method which took long time was high-cost. First of all, we collected 62 spectral data which have big differences in terms of resistant starch content of rice, and then the spectral data and detected chemical values are imported chemometrics software. After that a near-infrared spectroscopy calibration model for rice-resistant starch content was constructed with partial least squares (PLS) method. Results are as follows: In respect of internal cross validation, the coefficient of determination (R2) of untreated, pretreatment with MSC+1thD,pretreatment with 1thD+SNV were 0.920 2,0.967 0 and 0.976 7 respectively. Root mean square error of prediction(RMSEP)were 1.533 7,1.011 2 and 0.837 1 respectively. In respect of external validation, the coefficient of determination (R2) of untreated, pretreatment with MSC+1thD, pretreatment with 1thD+SNV were 0.805, 0.976 and 0.992 respectively. The average absolute error was 1.456, 0.818, 0.515 respectively. There was no significant difference between chemical and predicted values (Turkey multiple comparison), so we think near infrared spectrum analysis is more feasible than chemical measurement. Among the different pretreatment, the first derivation and standard normal variate (1thD+SNV) have higher coefficient of determination (R2) and lower error value whether in internal validation and external validation. In other words, the calibration model has higher precision and less error by pretreatment with 1thD+SNV.

Rice (OryzaeSativaL.); Resistant starch; Near-Infrared reflectance spectroscopy; Calibration model; Content detection

Dec. 12, 2014; accepted Apr. 16, 2015)

2014-12-12，

2015-04-16

國(guó)家“863”項(xiàng)目(2014AA10A603)， (2014AA10A604)， 國(guó)家水稻產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-01-11)和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(CXTD-1-1301)資助

羅 曦， 1982年生， 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所助理研究員 e-mail: luoxi9110@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: jianfzhang@163.com； huaanxie@163.com

S123； S511

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)03-0697-05