鄭健宇

糖尿病腎病患者高密度脂蛋白抗炎能力的分析

鄭健宇

目的 探討糖尿病腎病患者相對于正常人高密度脂蛋白抗炎能力是否降低。方法 將正常人和糖尿病腎病高密度脂蛋白分別處理THP-1細胞，通過ELISA檢測TNF-α、IL-6的含量，Western blot檢測NF-KB的活化。結果 在LPS刺激下，糖尿病腎病HDL相比于正常人HDL抑制THP-1細胞釋放TNF-α、IL-6和NF-KB活化的能力顯著下降。結論 糖尿病腎病相對于正常人高密度脂蛋白抗炎能力顯著下降,部分解釋糖尿病腎病動脈粥樣硬化風險升高。

高密度脂蛋白；炎癥因子；慢性腎臟??；動脈粥樣硬化

腎臟對維持機體正常運轉、從血液中過濾代謝產物及排出水分發(fā)揮著重要的功能。慢性腎臟疾病家族史、糖尿病、高血壓的患者更是慢性腎臟疾病的高危人群。近來的研究表明，慢性腎臟疾病增加了心血管疾病的風險[1]。大部分慢性腎臟病患者在疾病發(fā)展的不同階段都有罹患各種心腦血管疾病的可能。歐洲血脂異常管理指南明確提出中重度CKD患者具有極高的心血管總體風險，需要針對所有危險因素進行積極的干預治療[2]。高密度脂蛋白（HDL）是一種有益的脂蛋白，具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、降低血糖等一系列的機體保護作用。HDL能夠抑制ox-LDL誘導的單核細胞與內皮細胞、平滑肌細胞的相互作用以及單核細胞與內皮細胞的粘附[3]。研究認為，正常HDL能夠抑制細胞因子誘導的VCAM-1、ICAM-1和E-selectin的表達以及炎癥因子TNF-α,IL-1β的釋放[4-5]。但是在慢性腎臟病患者中HDL的抗炎功能是否發(fā)生改變還未有相關研究。糖尿病腎病是一類由糖尿病導致的慢性腎臟疾病命，發(fā)病率較高。故本研究選用糖尿病腎病患者作為慢性腎病的研究對象，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年8月～2014年8月在鄭州大學第二附屬醫(yī)院住院的慢性腎臟病患者18例（CKD組）,以目前早期慢性腎臟病診斷，以持續(xù)出現(xiàn)尿微量蛋白，尿蛋白／肌酐比≥30mg/g并≤300mg/g且出現(xiàn)糖尿病視網膜病變作為標準；正常對照12人（對照組），行75g無水葡萄糖耐量及糖化血紅蛋白檢查排除糖尿病，身體健康無腎病等其它病史。排除伴有高血壓、慢性肝病、其他原因導致的腎病、吸煙、家族性高膽固醇血癥、早發(fā)冠心病家族史者。慢性腎臟病患者相對于正常人尿素氮(BUN)、肌酸(Creatine)、總膽固醇(TC)、總甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白(LDL)含量均明顯升高，腎小球濾過率(GFR)和高密度脂蛋白(HDL)含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

1.2 HDL提取 將正常人血漿加入KBr，調整密度至1.3g/mL，在4度超速離心250000g離心150min，從上部到試管底部依次將血漿分層：橘紅色的VLDL和LDL，淡黃色的HDL（淡黃色）和無脂血漿。分別用長針頭吸取出LDL，HDL放入透析袋然后用0.01M PBS避光透析48h。培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β含量使用達科為酶聯(lián)免疫試劑盒檢測。通過蛋白印跡（western blot）檢測NF-kappa B中P65的磷酸化和GAPDH的含量，灰度分析采用Image J進行分析，以GAPDH灰度值進行校正。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS統(tǒng)計軟件20.0進行分析，計量資料采用“x±s”表示，2組均數間比較采用雙尾Student’s t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.001表示差異具有極顯著統(tǒng)計學意義。圖中，*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。

表1 2組一般臨床資料比較(x±s)

2 結果

2.1 慢性腎臟病HDL對內皮細胞炎癥因子的表達 分別用正常人和慢性腎臟病患者HDL預處理THP-1細胞2.5h,然后LPS預處理2.5h,使用ELISA試劑盒檢測培養(yǎng)基中TNF-α和IL-1β的含量。結果發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病患者相對于正常人HDL抑制LPS介導的TNF-α和IL-1β的釋放能力顯著降低。見圖1。

2.2 HDL通過NF-kappa B調節(jié)驗證因子的表達 由于NF-kappa B在調節(jié)細胞因子（如IL-1、IL-6、TNF-α）、黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1）的表達中發(fā)揮重要作用，因此檢測了2組HDL處理THP-1后NF-kappa B中P65亞基的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病HDL抑制P65磷酸化的能力降低。見圖2。

圖1 THP-1分別用LPS刺激，檢測加入CKD-HDL和N-HDL后4組中TNF-α和IL-1β的含量

圖2 采用western blot檢測不同HDL處理后THP-1中NF-kappa B P65亞基的磷酸化水平

3 討論

在慢性腎臟疾病中常伴有脂質代謝異常，表現(xiàn)為載脂蛋白和血脂水平改變。實驗和臨床研究提示，慢性腎臟病發(fā)展和血脂紊亂有一定關系,慢性腎功能不全患者早期表現(xiàn)為血TG水平升高,LDL濃度正常，而膽固醇濃度通常正常，甚至降低[6]。HDL水平降低。本實驗驗證相比于正常人、慢性腎臟病患者LDL水平升高，HDL水平降低。

血管炎癥反應主要是由于促炎因子與抗炎因子之間的不平衡所導致的[7]。HDL具有動脈保護性效應，HDL的抗炎功能是以多種方式發(fā)揮的，在內皮細胞中，正常人的HDL能夠抑制細胞粘附分子包括ICAM-1、VCAM-1以及E-selectin，抑制IL-8和MCP-1以及誘導抗炎性的TGF-β。白細胞與內皮細胞的粘附和白細胞與平滑肌細胞之間的相互作用在動脈粥樣硬化性斑塊的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。白細胞與內皮細胞的相互作用是由定位在這些細胞表面的粘附分子包括血管細胞粘附分子（VCAM-1）、細胞間粘附分子（ICAM-1）和E-選擇素（E-selectin）介導下發(fā)生的。腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）作為炎癥反應中的重要介質，它主要是由單核巨噬細胞受到各種因素的刺激被激活后合成和分泌的,可以促進炎性介質的釋放，巨噬細胞的浸潤，以及激活巨噬細胞，推動斑塊的形成以及不穩(wěn)定性的發(fā)展。TNF-α和IL-1β還可激活內皮細胞上的黏附分子（VCAM-1、ICAM-1），使其表達活性增加[8]。這些粘附分子吸引單核白細胞吸附在內皮組織上并且進一步往內膜方向遷移，使炎癥反應進而在血管壁上啟動[9]。TNF-α和

IL-1β除可作用于巨噬細胞并將其激活外，還促進平滑肌細胞增生、游走，并且能作用于血管內皮細胞，使內皮細胞活化、受損，進一步導致血管受損和血栓形成[10-11]。本實驗發(fā)現(xiàn)相比于正常

HDL，慢性腎臟病HDL抑制LPS導致的TNF-α、IL-1β能力降低，因此結果可以部分解釋慢性腎臟病動脈粥樣硬化疾病發(fā)生風險升高。

NF-kappa B是一種能調節(jié)多種炎性和免疫基因表達的重要轉錄因子。正常情況下，NF-kappa B與其抑制蛋白結合形成無活性的三聚體復合物，存在于胞漿內。在促炎癥細胞因子的作用下，NF-kappa B P65亞基磷酸化并移位至細胞核，其核定位序列與靶基因的啟動子或增強子發(fā)生特異性結合，啟動轉錄表達。同時由于NF-kappa B對動脈粥樣硬化中多種炎性介質（TNF-α、IL-1β）的表達起著關鍵性的調控作用，所以動脈粥樣硬化中NF-kappa B的含量和活性升高可增強多種炎癥因子的轉錄和生成增多，引起持續(xù)的炎癥反應，通過對靶基因的作用，NF-kappa B能促進單核細胞的粘附遷移、泡沫細胞的形成及積聚、平滑肌細胞的從中膜到內膜的遷移增殖。這些作用促進粥樣斑塊的形成和發(fā)展，使內膜增厚、管腔狹窄，加重病變程度[12]。文獻表明正常狀態(tài)下HDL與apoA-I可以通過作用于TLR4受體阻斷NF-kappa B的活化[13]，抑制多種炎癥因子的表達，減輕炎癥反應和級聯(lián)瀑布效應。我們通過細胞免疫印跡發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病HDL處理后THP-1中NF-kappa B P65亞基的磷酸化水平相比于正常HDL明顯增高。因此，對于慢性腎臟病患者，其HDL抑制NF-kappa B P65亞基磷酸化能力降低，炎性介質（TNF-α、IL-1β）的表達增加，進一步使大量炎性細胞積聚浸潤于炎癥部位，導致持續(xù)或放大的炎癥反應。這些炎癥反應促進粥樣斑塊的形成和發(fā)展，使內膜增厚、管腔狹窄，加重病變程度。

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Objective To investigate whether the anti-inflammatory effects of HDL is impaired in chronic kidney disease. Methods THP-1 cells were treated with N-HDL (normal),CKD-HDL (chronic kidney disease).TNF-α,IL-1β content was detected with ELISA kit and NF-kappa B phosphorylation were analyzed by western blot.Results CKD-HDL was less effective than N-HDL in TNF-αand IL-6 release inhibition (P＜0.05). NF-kappa B phosphorylation were reduced in CKD-HDL in comparison with N-HDL.Conclusion We found that HDL from chronic kidney disease has a lower anti-inflammatory effects which partially explains why CKD patients have a higher risk of cardiovascular disease.

High density lipoprotein; Inflammatory factors; Chronic kidney disease; Atherosclerosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.21.001

河南 475000 河南省開封市中心醫(yī)院輸血科 （鄭健宇）