崔雪平

免疫組織化學(xué)二步法檢測原發(fā)性肝癌組織GP73蛋白表達(dá)的結(jié)果分析

崔雪平

目的 分析原發(fā)性肝癌組織GP73蛋白表達(dá)的結(jié)果。方法 選取手術(shù)切除原發(fā)性肝癌組織的患者35例，采用免疫組織化學(xué)二步法檢測31例原發(fā)性肝癌組織、28例癌旁組織、10例肝硬化肝組織和11例正常肝組織的GP73蛋白的表達(dá)。結(jié)果 GP73蛋白表達(dá)主要位于肝癌組織、癌旁組織、肝硬化肝組織的細(xì)胞中，其細(xì)胞質(zhì)會出現(xiàn)黃色、棕黃色、黃褐色的著色顆粒。在肝癌組織中，GP73陽性率為93.5%(29/31)；在癌旁組織中，GP73陽性率為92.9%(26/28)；在肝硬化肝組織中，GP73陽性率為40.0%(4/10)；在正常肝組織中，GP73陽性率為27.2%(3/11)。在GP73蛋白陽性表達(dá)率方面，肝硬化肝組織與正常肝組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝癌組織相比與癌旁組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與肝硬化肝組織和正常肝組織相比，肝癌組織和癌旁組織的GP73蛋白的陽性表達(dá)率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 GP73蛋白是肝癌組織病理標(biāo)志物，可以作為肝癌診斷的標(biāo)記蛋白。

原發(fā)性肝癌組織；免疫組織化學(xué)二步法；GP73蛋白；表達(dá)

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，病死率很高，對人們的身體健康和生命安全均產(chǎn)生了極大的威脅。在我國，原發(fā)性肝癌的致死率一度超過45%[1]，且呈現(xiàn)出東南沿海地區(qū)發(fā)病率高，欠發(fā)達(dá)地區(qū)發(fā)病率低，男性患病率高，女性患病率低的特點(diǎn)。盡管病因和發(fā)病機(jī)制并未確定，但早診斷、早發(fā)現(xiàn)、早治療能達(dá)到良好的臨床療效。文獻(xiàn)報(bào)道，在發(fā)生病變的肝細(xì)胞中，GP73表達(dá)會明顯升高[2]，相對于AFP，GP73診斷肝癌更加靈敏和準(zhǔn)確。本研究以31例原發(fā)性肝癌組織、28例癌旁組織、10例肝硬化肝組織和11例正常肝組織為例進(jìn)行論述，分析原發(fā)性肝癌組織GP73蛋白表達(dá)的結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月～2014年7月在尉氏縣人民醫(yī)院手術(shù)切除原發(fā)性肝癌組織的患者35例，其中膽管細(xì)胞型肝癌患者20例，肝細(xì)胞肝癌患者15例，該組患者的病情均經(jīng)病理證實(shí)，均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，31原發(fā)性肝癌組織，并于肝癌組織2cm以內(nèi)取癌旁組織，癌旁組織鏡下未見癌細(xì)胞，共28例。選擇2013年6月～2014年7月在本院接受治療的13例肝硬化患者，取肝硬化肝組織，共10例；選擇

2013年6月～2014年7月在本院接受治療的12例外傷性肝破裂患者，取正常肝組織，共11例。

1.2 方法 采用免疫組織化學(xué)二步法對原發(fā)性肝癌組織GP73蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。利用10%甲醛溶液、石蠟，經(jīng)過一列的處理，把新鮮組織制成4μm厚連續(xù)切片。具體步驟如下：（1）用二甲苯和梯度乙醇對切片進(jìn)行脫蠟處理，并進(jìn)行自來水清洗，PBS清洗3次；（2）利用微波爐和

EDTApH=9.0抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)處理，然后在常溫環(huán)境下冷卻0.5h，最后PBS清洗3次；（3）去離子水孵育在3%H2O2中進(jìn)行，10min后用PBS清洗3次；（4）37℃烤箱孵育；（5）滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，放入烤箱，調(diào)至37℃進(jìn)行孵育，2/3h后取出并用PBS清洗3次；（6）使用DAB顯色液進(jìn)行顯色處理；（7）使用自來水洗滌干凈后，然后進(jìn)行復(fù)染、脫水、膠封；（8）利用PBS進(jìn)行陰性對照。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察指標(biāo)主要是陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)和細(xì)胞質(zhì)染色。細(xì)胞質(zhì)染色：黃色得1分，棕褐色得3分，無色不得分，棕黃色得2分。陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)：≤10%不得分，11%～50%得1分，51%～75%得2分，≥76%得3分。兩項(xiàng)得分相加：4～6分為強(qiáng)陽性，2～3分為陽性，0～1分為陰性。

2 結(jié)果

2.1 GP73蛋白的表達(dá)情況 GP73蛋白表達(dá)主要位于肝癌組織、癌旁組織、肝硬化肝組織的細(xì)胞中，其細(xì)胞質(zhì)會出現(xiàn)黃色、棕黃色、黃褐色的著色顆粒。

2.2 不同組織中的GP73陽性率比較 在肝癌組織中，GP73陽性率為93.5%(29/31)；在癌旁組織中，GP73陽性率為92.9%(26/28)；在肝硬化肝組織中，GP73陽性率為40.0%(4/10)；在正常肝組織中，GP73陽性率為27.2%(3/11)。見表1。在GP73蛋白陽性表達(dá)率方面，肝硬化肝組織與正常肝組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；肝癌組織相比與癌旁組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與肝硬化肝組織和正常肝組織相比，肝癌組織和癌旁組織的GP73蛋白的陽性表達(dá)率更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

組別例數(shù)陽性例數(shù)陽性率(%)肝癌組織312993.5癌旁組織282692.9肝硬化肝組織10440.0正常肝組織11327.2

3 討論

轉(zhuǎn)移早、手術(shù)后復(fù)發(fā)率高、進(jìn)展快、生存期短、預(yù)后差是原發(fā)性肝癌最主要的臨床特點(diǎn)。我國是肝癌發(fā)生率較高的國家，肝癌的臨床治療和研究已經(jīng)給我國醫(yī)療資源帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。原發(fā)性肝癌可歷時(shí)20～50年，由慢性肝炎慢慢發(fā)展成肝硬化并最終惡化成肝癌。對于原發(fā)性肝癌的治療，早診斷、早發(fā)現(xiàn)非常重要，能顯著提升患者的生存率，改善預(yù)后。

在之前，甲胎蛋白（AFP）是肝細(xì)胞肝癌的主要血清標(biāo)志物，但是其敏感性并不是非常理想，在報(bào)道中由39%～65%，平均水平大約在50%[4]，然而在實(shí)際的臨床醫(yī)療中，部分早期肝癌患者仍然無法得到早期診斷和治療。

有研究發(fā)現(xiàn)人巨細(xì)胞性肝炎的過程中發(fā)現(xiàn)了一種編碼基因全長達(dá)3042bP的跨膜糖蛋白[5]。該蛋白本身位于高爾基體順面膜囊上，在細(xì)胞質(zhì)中呈點(diǎn)狀分布，其編碼基因位于第9號染色體的長臂上，由于相對分子質(zhì)量是7.3×104，所以該跨膜糖蛋白被命名為GP73。最初的研究指出，GP73很少在正常的肝細(xì)胞中表達(dá)，多見于人類正常組織的上皮細(xì)胞。后來有學(xué)者指出，病變或癌變組織的GP73表達(dá)明顯高于正常組織，將可能成為更好的診斷肝癌尤其是早期肝癌的血清標(biāo)志物[6]，因此而成為GP73開始成為肝癌臨床治療的一個(gè)重要研究方向。

本研究結(jié)果顯示，正常肝組織、肝硬化肝組織、癌旁組織、肝癌組織的GP73陽性表達(dá)率分別為27.2%、40.0%、92.9%、93.5%，呈現(xiàn)一個(gè)逐步上升的趨勢，其中正常肝組織、肝硬化肝組織處于一個(gè)輕微表達(dá)的階段，癌旁組織、肝癌組織處于一種高度表達(dá)的階段，也可能是因?yàn)樵l(fā)性肝癌與GP73之間有一個(gè)相互促進(jìn)機(jī)制。

相關(guān)研究表明，GP73的表達(dá)多發(fā)生于正常組織的上皮細(xì)胞中，而在正常肝臟組織中，除了匯管區(qū)周圍的膽管上皮細(xì)胞，肝臟組織的其它細(xì)胞是不會表達(dá)GP73的[7]。而表達(dá)GP73的膽管上皮細(xì)胞也是非常少的，呈點(diǎn)狀分布于細(xì)胞質(zhì)中。隨著進(jìn)一步的研究，人們發(fā)現(xiàn)發(fā)病的或者癌變的組織細(xì)胞中，GP73的表達(dá)率是非常高的。在McMahon的研究中[8]，相對于肝硬化及健康兩個(gè)對照組，實(shí)驗(yàn)組PHC患者血清GP73水平明顯升高，說明GP73具有一定的輔助診斷價(jià)值。在國外，由于受到苛刻的道德倫理限制，國外很少使用人體肝癌組織進(jìn)行GP73蛋白表達(dá)的研究，對肝癌組織和肝硬化肝組織中GP73蛋白更是少之又少，并且即使是有所研究，也大多都局限于免疫組織化學(xué)水平。但是到目前為止，還沒有關(guān)于肝癌組織、對應(yīng)的癌旁組織還有正常的肝組織中GP73蛋白和MRNA的表達(dá)方面的報(bào)道，也沒有相關(guān)研究報(bào)道GP73蛋白及mRNA的表達(dá)情況與肝癌患者臨床病理還有預(yù)后等方面之間聯(lián)系的研究，除此之外，也沒有相關(guān)研究來闡明GP73在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及其與肝癌的因果關(guān)系等方面。

本研究結(jié)果顯示，在29例原發(fā)性肝癌組織的細(xì)胞中GP73的表達(dá)呈陽性或強(qiáng)陽性，并在癌細(xì)胞質(zhì)中能發(fā)現(xiàn)黃色、黃褐色的染色顆粒，占總數(shù)的93.5%(29/31)；在26例癌旁組織的細(xì)胞中GP73的表達(dá)呈陽性，并在癌細(xì)胞質(zhì)中能發(fā)現(xiàn)以黃褐色為主的染色顆粒，占總數(shù)的92.9%(26/28)；肝硬化肝組織和正常組織的染色陽性更弱。也就是說，相對于肝硬化肝組織和正常肝組織，肝癌組織和癌旁組織中的GP73表達(dá)陽性率更高。

綜上所述，采用免疫組織化學(xué)二步法檢測原發(fā)性肝癌組織GP73蛋白表達(dá)，GP73蛋白對肝癌的診斷提供了新的方法，能有效地標(biāo)記原發(fā)性肝癌組織細(xì)胞。

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[4] 葉佩靈，何欣欣，吳曉蔓，等.原發(fā)性肝癌組織中GP73蛋白的表達(dá)[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014，35(2)：234-236.

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[6] 高萬軍，祁楠.原發(fā)性肝癌組織中OPN、GP73的表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2014，54(2)：60-61.

[7] 賽文莉，陳雯，姚登福，等.聯(lián)合檢測Ang-2和GP73對原發(fā)性肝癌診斷與鑒別的臨床價(jià)值[J].世界華人消化雜志，2015(25)：4032-4040.

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10.3969/j.issn.1009-4393.2016.18.019

河南 475500 尉氏縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（崔雪平）