周奕洲 王淑雯 羅嘉偉 劉永達

金錢草提取液對大鼠腎TRPV5表達影響的實驗研究

周奕洲 王淑雯 羅嘉偉 劉永達

目的 探討金錢草提取液對草酸鈣結石大鼠的成石抑制作用及可能的作用機制。方法 30只健康雄性大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組（A組）、單純結石組（B組）、金錢草干預組（C組），每組10只。A組給予生理鹽水2mL/d；B組給予成石液（1%乙二醇飲水+1%氯化銨）2mL/d灌胃；C組給予成石液2mL/d+金錢草提取液2mL/d灌胃。各組大鼠在相同條件下共飼養(yǎng)56d后，光鏡下觀察各組大鼠腎組織切片中草酸鈣結晶分布及組織病理改變；免疫組化，從蛋白水平分析TRPV5在各組大鼠中的表達情況。結果 A組和C組大鼠腎組織均不能觀察到結石結晶，B組大鼠可發(fā)現(xiàn)多量的黑色鈣鹽結晶體沉積于腎小管腔內(nèi)。A組、B組和C組TRPV5免疫組化陽性百分比分別為（47.40±14.04）%，（17.49±8.35）%和（28.41±10.12）%。與A組相比，B組大鼠的TRPV5表達量顯著減少（P＜0.01）；與B組相比，C組大鼠腎組織的TRPV5蛋白表達水平明顯提高（P＜0.01）。結論 金錢草提取液能夠抑制大鼠腎臟組織草酸鈣結晶的形成，其作用機制可能通過上調TRPV5表達量，從而減少了腎小管內(nèi)鈣鹽結晶體的形成，具有保護腎臟的作用。

草酸鈣結石；金錢草；TRPV5

尿路結石是世界各地共同存在的疾病，嚴重影響人類的健康。在中國，尿路結石是泌尿外科疾病最常見病種之一。近年來，由于人們對健康的重視以及醫(yī)療水平的發(fā)展，泌尿系結石的發(fā)病率明顯增高。泌尿系結石大多是草酸鈣結石，鈣是結石成分中最主要的陽離子，含鈣結石患者往往伴尿鈣增多。有學者研究發(fā)現(xiàn)大約1/3的含鈣結石患者發(fā)現(xiàn)尿鈣增多[1]。尿鈣離子增多時，無論是草酸鈣還是碳酸鈣，達到一定飽和度時即可形成結石，引起尿路梗阻[2]。最近研究揭示，鈣離子轉運通道V5（transient receptor potential cation channel V5，TRPV5）在人體腎臟集合管和遠端小管上皮上高度表達，其存在對尿路鈣離子重吸收方面潛在著重要的影響[3]。王少剛等[4]研究發(fā)現(xiàn)遺傳性高鈣尿結石大鼠TRPV5表達明顯減少，大鼠尿路上的鈣離子不能有效通過TRPV5重吸收，繼而出現(xiàn)尿鈣過飽和，草酸鈣結石因此形成。

金錢草的正品是報春花科植物過路黃(lysimachia christinae hance）的新鮮或干燥全草。金錢草具有清熱祛濕、利尿通淋的功效，以單味或組方配伍形式廣泛應用于治療尿路結石和膽道結石。金錢草經(jīng)過不斷研究，目前證實其不但能有效清除氧自由基，對組織起到抗氧化作用[5]，可降低尿鈣的排泄[6]，以往的研究也提示金錢草具有降低尿鈣含量的作用[7]，但具體機制尚不明確。鑒于此，通過該實驗，提取金錢草濾液的1%乙二醇飲水+1%氯化銨的溶液對大鼠進行灌胃干預性給藥8周，然后制作腎臟石蠟切片并觀察腎組織草酸鈣結晶及病理變化，檢測TRPV5表達水平，擬探討金錢草降低尿鈣的可能機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 購于廣州醫(yī)科大學實驗動物中心SD大鼠，均為雄性，體質量180～220g。

1.2 主要試劑和儀器 金錢草飲片，購于康美藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)地廣東；乙二醇(C2H6O2)，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)；氯化銨(NH4Cl)，滬市生產(chǎn)；一抗（TRPV5）鼠抗人單克隆抗體(濃縮液)Envision免疫組化試劑盒(即用型)，購于Gene Tech(Shanghai)Company Limited；顯微鏡（日本尼康公司)；BMJ-Ⅲ型病理組織漂烘儀(中威醫(yī)療儀器有限公司)；TSJ-Q型全自動封閉式組織脫水機(中威醫(yī)療儀器有限公司)；徠卡-2015型切片機(德國徠卡公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 金錢草濾液的提取和制備 金錢草飲片15kg，先泡水約半小時，接著煎煮至沸騰后半小時，濾去藥渣，濾液濃縮成浸膏3500mL，最終配成濃度為1.5g/mL的金錢草溶液。

1.3.2 成石液的制備 參考文獻[8]制備草酸鈣結石模型：將1%乙二醇與1%氯化銨，用蒸餾水配制而成的混合溶液。配制比例為：乙二醇1mL，氯化銨1g，用蒸餾水定容到100mL。

1.3.3 動物分組及模型制作 將動物適應性喂養(yǎng)7d后，采用完全隨機抽樣分為3組：空白對照組（A組），給予生理鹽水2mL/d；單純結石組（B組），給予草酸鈣成石液2mL/d；金錢草干預組（C組），給予金錢草提取液2mL/d+成石液2mL/d。每組10只，以灌胃方式連續(xù)給藥56d。

1.3.4 腎臟切片的制作及HE染色 喂養(yǎng)56d后，處死大鼠，切取左側腎臟，然后將切取的標本固定于10%甲醛溶液中，維持1d后，用流動清水持續(xù)沖洗標本，接著將其置于80%的乙醇2h，之后置于90%的乙醇，2h后，再將標本置于95%乙醇，2h后再置于100%乙醇，2h后，將標本浸泡在二甲苯溶液中，2h后取出標本，浸泡于二甲苯和熔化的石蠟等比例混合溶液中，持續(xù)時間1h，接著取出標本浸泡于2個熔化的石蠟液里，3h后將熔化的石蠟液置于陰涼地方冷卻，之后用石蠟切片機將凝固的石蠟塊切成薄蠟帶，數(shù)量5～8張，厚度5μm。最后在玻片涂上粘附劑，將蠟帶固定在玻片上，于干燥箱里烘烤，溫度45℃，時間1h。

1.3.5 免疫組化 將活體組織取材置于中性福爾馬林固定，經(jīng)全自動脫水機（固定、脫水、浸蠟），包埋，切片，至烤箱60℃～70℃30min，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水洗2遍，4%雙氧水浸泡，8min后用EDTAph8.0高壓鍋修復抗原。具體步驟如下：煮沸后，放入病理切片，密封高壓鍋，等噴氣后過2min，移至陰涼處冷卻，取出切片加入抗體一（肥大細胞類胰蛋白酶），放入水浴箱約40min，溫度調為37℃。取出切片，用PBS（ph7.3)持續(xù)沖洗12min，接著加入抗體二（Dako Envision K5007），置于室溫環(huán)境，20min后用上述PBS再次持續(xù)沖洗切片，12min后用DAB（Dako Envision K5007）進行顯色，用蒸餾水隨時終止顯色結果，在清水沖洗后用蘇木素復染，2min后用95%酒精浸泡，取出烘干，最后用中性樹膠封片。

1.3.6 取3組腎組織病理切片（包括免疫組織切片），在顯微鏡下在高倍視野下觀察并拍照，將拍得的照片載入電腦，并用圖像軟件（Image-pro plus 6.0）測定各組所獲照片的陽性區(qū)域面積。

1.4 統(tǒng)計學方法 本研究實驗數(shù)據(jù)運用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用“x±s”表示，隨機單位組設計資料用單因素方差分析（ANOVA檢驗），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.1 大鼠腎臟標本病理特點 腎標本病理切片在顯微鏡下可見A組中腎小球結構完整，未見硬化，腎小管未見萎縮，腎間質未見纖維化，集合管未見圓柱形蛋白聚體。與A組比較，B組和C組大鼠盡管腎小球結構清晰，但仍見有腫脹或萎縮、纖維化、部分腫大的近曲小管上皮細胞溶解，部分遠曲小管管壁僵硬，管腔變小，間質偶見血管充血，提示造模后大鼠腎臟有不同程度的炎癥損害。B組和C組鏡下觀察損傷的性質基本相同，但C組損傷的范圍明顯少于B組。見圖1。

2.2 大鼠腎臟標本結晶特點 腎標本病理切片在顯微鏡下可見無論A組還是C組，腎標本切片均未見結晶沉積，B組大

2 結果

鼠可發(fā)現(xiàn)多量的黑色鈣鹽結晶體沉積于小管腔內(nèi)，結晶性質不規(guī)則，團簇狀存在，甚至堆積成大片。見圖1。

圖1 光鏡示各組大鼠組織草酸鈣結晶(箭頭所示)情況(HE，×400)

2.3 大鼠腎臟TRPV5表達特點 TRPV5的表達情況可以運用免疫組化染色進行檢測，如圖2所見：棕黃色的陽性染色顆粒沉積于各組（包括A組、B組和C組）的腎小管上皮細胞膜上，而陽性染色在B組和C組顯示的強度明顯低于A組，而與B組相比，C組陽性染色強度較高。表1是TRPV5的免疫組化陽性百分比（%）結果顯示：與A組相比，B組大鼠的TRPV5表達量顯著減少（P＜0.01）；與B組相比，C組大鼠腎組織的TRPV5蛋白表達水平明顯提高（P＜0.01）。從以上可以推測，金錢草可能潛在著上調腎組織中TRPV5表達量的作用，增加尿中鈣離子的重吸收，繼而降低尿鈣濃度，最終減少了腎小管內(nèi)鈣鹽結晶體的形成。

圖2 各組大鼠腎組織TRPV5免疫組化圖

表1 3組大鼠免疫組化檢查結果（x±s）

3 討論

血中鈣離子通過腎小球濾過，繼而經(jīng)過腎小管的重吸收，最終決定了尿中鈣離子的濃度。腎小管對鈣吸收有的重兩種方式：主動重吸收和被動重吸收。其中主動重吸收發(fā)生的部位在腎遠端小管和集合管，是一種耗能的轉運方式，在兩種吸收方式對尿中鈣離子總吸收量中，主動重吸收僅占的15%[9]，然而它是大部分鈣離子調節(jié)因子的控制因素，能特異的調節(jié)尿中鈣離子的濃度。有研究表明，腎小管上皮細胞膜是TRPV5蛋白表達的主要部位，而TRPV5是尿中鈣離子主動重吸收的關鍵調控蛋白，當它大量表達時，可以有效地降低尿中鈣離子的濃度[10]。Boros等[11]應用免疫組織化學方法證實了小鼠腎遠曲小管及集合管的上皮細胞膜上有較高水平的TRPV5的表達，進一步對TRPV5基因敲除后發(fā)現(xiàn)，尿鈣排泄量比正常對照組高出6倍，推測試TRPV5的本身缺陷所致。國內(nèi)學者對草酸鈣腎結石模型研究中也發(fā)現(xiàn)，與A組相比，成石組腎標本的TRPV5mRNA的表達水平明顯降低，TRPV5作為腎臟中一種新型的鈣離子通道，主要表達于腎小管，當TRPV5表達量減少時，降低對尿鈣離子的重吸收量，當尿中鈣離子達到一定飽和度時，草酸鈣即能以晶體形式沉積下來[2]。

過去研究發(fā)現(xiàn)金錢草可以降低尿中鈣離子的濃度[7]。研究中有一個缺陷是沒成功收集到各組大鼠尿液，未能對各組大鼠尿鈣進行分析。但是，病理結果發(fā)現(xiàn)，B組的腎臟鈣鹽沉積明顯高于A組和C組。Finlayson[12]等研究發(fā)現(xiàn)，氯化銨作為一種酸化試劑，長期作用于腎小管可以引起腎毒性，促進草酸鈣結晶的沉積。Water等[13]給大鼠飼喂氯化銨和乙二醇混合液，28d后將大鼠進行病理組織檢查，發(fā)現(xiàn)大片草酸鈣晶體分布于腎實質，同時觀察到腎小球纖維樣變、近端小管和遠端小管萎縮。本實驗發(fā)現(xiàn)B組和C組的腎組織病理切片均可觀察到腎間質部分血管充血，部分腎小球腫脹或纖維化，腎小管上皮細胞腫大，管腔變細，偶見個別上皮細胞破裂。除此之外，B組尚可見較多結石結晶形成。而A組大鼠腎切片，腎小球結構清晰，未見明顯腫脹、萎縮和纖維化，刷毛緣尚完整，未見結石結晶形成。這提示腎毒性藥物氯化銨在造模中的重要作用，同時也提示乙二醇+氯化銨聯(lián)用，造模成石效果確切。A組大鼠腎標本切片免疫組化后，發(fā)現(xiàn)腎小管表達較多的TRPV5蛋白。而B組的大鼠表達的TRPV5明顯減弱，而相對B組，C組的TRPV5表達量上調，由此認為，金錢草提取液可能通過上調TRPV5的表達量，進而減少尿鈣的排泄量，最終減少鈣鹽晶體在大鼠腎小管沉積。

綜上所述，金錢草提取液在腎草酸鈣結石模型大鼠中可明顯抑制晶體形成，并有一定上調腎臟TRPV5的表達量。這種潛在的上調TRPV5表達作用可能是金錢草提取液防治泌尿系結石的作用機制之一。

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Objective To investigate the effect of aqueous extract from herba lysimachiae on calcium oxalate-induced kidney injury in vivo and fnd its possible mechanism. Methods The 30 healthy adult male rats were randomized into three groups: control group (group A), stone group (group B), herba lysimachiae group (group C). Group A was established with physiological saline by gavage (2mL per day), while Group B was established with 1% ammonium chloride and 1% ethylene glycol in drinking water by gavage (2mL per day), and group C were established with aqueous extract from herba lysimachiae (2mL per day) by gavage on the basis of group B (2mL per day). After feeding for 56 days, the rats from each group were sacrifced and we observed the location of crystallization of calcium oxalate in vivo kidney tissue and evaluated the pathological changes by microscopy. The location and protein content of TRPV5 expression in kidney tissue was detected by immunohistochemical staining. Results The kidney tissue of rats in both group A and group C were not observed crystallization of calcium, but the group B can be found a large amount of black crystals of calcium deposited in the renal tubules. The protein contents of TRPV5 in three groups were (47.40±14.04)%, (17.49±8.35)% and (28.41±10.12)% respectively. Compared with group A, the results of the protein content of TRPV5 were much lower than those in group B. Compared with group B (P＜0.01), the results of the protein content of TRPV5 were much higer than those in group C (P＜0.01). Conclusion The aqueous extract from herba lysimachiae seemed to prevent the formation of renal calcium oxalate crystallization in rats, which is probably due to the mechanism of upregulating the expression of TRPV5, thereby reducing the formation of crystallization of calcium in the renal tubules, and playing a role in protecting the kidneys.

Herba lysimachiae; Calcium oxalate; TRPV5

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.18.001

2011年廣州市科技計劃項目（2011J4100054）

廣東 510120 廣東省泌尿外科重點實驗室 （周奕洲 王淑雯羅嘉偉 劉永達）

劉永達 E-mail：liuyongda.jinbi@163.com