牟　娜　樊秀紅　郭連峰　李　寧　曾瑞紅

(河北衡水哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院，衡水053000)

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模式識(shí)別受體TLR3、RIG-I和MDA5在慢性乙肝患者外周血的表達(dá)水平①

牟娜樊秀紅②郭連峰李寧曾瑞紅③

(河北衡水哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院，衡水053000)

[摘要]目的：觀察慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血中單個(gè)核細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)模式識(shí)別受體mRNA的表達(dá)表達(dá)水平。方法：54例慢性乙型肝炎患者為實(shí)驗(yàn)組， 40例健康體檢者為對(duì)照組。采集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的新鮮空腹抗凝血，分離單個(gè)核細(xì)胞，提取單個(gè)核細(xì)胞中RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測Toll樣受體3(TLR3)、維甲酸誘導(dǎo)基因-I(RIG-I)、黑色素瘤分化相關(guān)分子5(MDA5)、I型干擾素(IFN-α、IFN-β)、轉(zhuǎn)錄因子3(IRF-3)mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA表達(dá)水平均明顯降低，具有顯著性差異(P<0.05)。高病毒載量組中的各分子表達(dá)水平與低病毒載量組和健康對(duì)照組比較降低更明顯，且TLR3、RIG-I、MDA5、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平分別與HBV-DNA的含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.697、-0.738、-0.867、-0.618、-0.415、-0.573)。結(jié)論：細(xì)胞胞膜(TLR3)和胞質(zhì)(RIG-1、MDA5)模式識(shí)別受體、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平在慢性乙型肝炎患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)降低，可能與HBV感染的慢性化狀態(tài)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]慢性乙型肝炎；TLR3；RIG-1；MDA5；IFN-α；IFN-β；IRF-3

目前全世界約有3.5億慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染者，約占全球人口的6%，我國作為乙肝的多發(fā)流行區(qū)，約占全球HBV表面抗原總攜帶率的50%，且60%的人受過HBV的感染[1]。慢性乙型肝炎是由HBV感染而致病的炎癥性疾病，感染持續(xù)半年以上，表現(xiàn)為持續(xù)性感染。乙型肝炎的治療最終取決于宿主免疫系統(tǒng)與病毒毒力之間的力量對(duì)比。天然免疫是機(jī)體抵抗病毒感染的重要防線，在抵抗乙型肝炎病毒感染時(shí)同樣發(fā)揮著重要的作用[2]。

天然免疫系統(tǒng)要依賴識(shí)別受體模式識(shí)別入侵的外源病原微生物，然后將其清除掉。哺乳動(dòng)物主要具有兩類微生物識(shí)別系統(tǒng),一類是膜結(jié)合受體,如Toll樣受體(Toll like receptors,TLR)[3],存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞器室膜上，識(shí)別胞外微生物,然后活化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng);另一類是細(xì)胞質(zhì)中的模式識(shí)別受體,包括具有螺旋酶結(jié)構(gòu)域的抗病毒蛋白視黃酸(維甲酸)誘導(dǎo)基因蛋白I (Retinoic acid inducible gene,RIG-1)和黑色素瘤分化相關(guān)抗原5 (Melanoma differentiation-associated gene5,MDA5)，在病毒感染過程中，這些分子均可識(shí)別病毒的RNA，在機(jī)體抗病毒的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著十分重要的作用。本研究旨在考察兩類模式識(shí)別受體(TLR3、RIG-1、MDA5)和I型干擾素在慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)情況。為探索慢性乙肝的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料收集2012年11月至2014年1月之間來河北省衡水市哈勵(lì)遜國際和平醫(yī)院就診的慢性乙型肝炎患者54例為實(shí)驗(yàn)組，其中男32例，女22例。年齡18～64歲;平均年齡(38.8±10.7)歲。診斷均符合《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。另同期收集40例排除慢性乙型肝炎等多種疾病的健康人為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，其中男性26例，女性14例；年齡21～59歲，平均年齡(36.7±9.8)歲。兩組在性別、年齡的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究得到我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得所有受試者的知情同意。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.1.2.1主要試劑淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)。Total RNA提取試劑[寶生物工程(大連)有限公司]；PCR反應(yīng)體系(康為世紀(jì)公司)；PCR引物[英濰捷基(上海)有限責(zé)任公司]；DEPC水(美國Promega公司)。ELISA試劑盒(北京欣博盛生物科技有限公司)。

1.1.2.2主要儀器熒光定量PCR儀[上海宏石醫(yī)療科技有限公司(SLAN)]；生物安全柜[濟(jì)南市鑫貝西生物技術(shù)有限公司(BSC-1100ⅡB3)]；酶標(biāo)儀[芬蘭Labsystem Dragon公司(Wellscan MK2)]；恒溫水浴箱[北京市永光明醫(yī)療儀器廠(DHP-600)]；干式恒溫器[江蘇省海門其林貝爾儀器制造公司(GL-150B)]；低溫超速離心機(jī)[珠海黑馬醫(yī)療器械公司(TGL-16R)]。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本采集在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組人員空腹的狀態(tài)下各采集全血8 ml，其中2 ml加入到干管中使血清自然析出，用來檢測生化指標(biāo)和干擾素的蛋白質(zhì)含量；剩余的6 ml則平均加到兩個(gè)肝素抗凝管中，每管3 ml，馬上對(duì)其進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞的分離。把分離好的單個(gè)核細(xì)胞和收集好的血清分別進(jìn)行編號(hào)、記錄后，保存于-80℃的低溫冰箱中備用。

1.2.2提取RNA按照Trizol說明書提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的單個(gè)核細(xì)胞，加入Trizol試劑使細(xì)胞充分溶解，得到勻漿裂解液放-80℃低溫冰柜保存，以備集中提取RNA。在裂解液中加入1/5體積量的氯仿，劇烈震蕩充分乳化。12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上清液，加入1 ml的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻，室溫靜置10 min。12 000 r/min，4℃離心10 min。得到總RNA。75%的DEPC酒精1 ml洗滌RNA，在用DEPC水溶解RNA。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄將1 μl的 Oligo(dT)18 primer，3 μl 的已提取的RNA，8 μl 的Water,nuclease-free，總共為12 μl，混勻，置于65℃干熱恒溫器上，5 min。然后加入4 μl 的5×Buffer，1 μl的RiboLock Rnase inhibitor(20 U/μl),2 μl的Mm dNTP Mix和1 μl的RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase(200 U/μl)，點(diǎn)動(dòng)離心，置于42℃水浴箱，1 h；最后放在干熱恒溫器上，將其調(diào)至70℃，5 min。

1.2.4PCR反應(yīng)體系和流程體系：2×UltraSYBR Mixture(With ROX)25 μl+ Forward Primer (10 μmol/L) 1.0 μl+ Reverse Primer (10 μmol/L)1.0 μl + cDNA 1.0 μl + RNase-Free Water 22 μl；流程： 預(yù)變性：95℃,10 min→變性:95℃,15 s→退火/延伸：60℃,1 min。共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后通過凝膠成像，經(jīng)全自動(dòng)凝膠成像分析儀掃描DNA條帶灰度值，軟件分析條帶灰度比值。

1.2.5計(jì)算方法計(jì)算方法:mRNA 的相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT表示[5]①實(shí)驗(yàn)組測定CT值減去其內(nèi)參的CT值，得到△CT1。②正常對(duì)照組CT值減去其對(duì)應(yīng)內(nèi)參CT值，得到△CT2，從△CT2找出一個(gè)適中的數(shù)值做標(biāo)準(zhǔn)△CT。③實(shí)驗(yàn)組△CT1減去標(biāo)準(zhǔn)△CT，得到△△CT1，計(jì)算出2-△△CT1。④正常對(duì)照組△CT2減去標(biāo)準(zhǔn)△CT，得到△△CT2，計(jì)算出2-△△CT2。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6血清HBV DNA檢測所有標(biāo)本均在室內(nèi)質(zhì)量控制合格的條件下進(jìn)行檢測。采用PCR結(jié)合熒光探針的體外DNA擴(kuò)增和檢測技術(shù)定量檢測DNA含量。根據(jù)患者HBV拷貝數(shù)分為高病毒載量(>105copies/ml)和低病毒載量(<105copies/ml)。血清IFN-α和IFN-β蛋白檢測：采用ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，測出的標(biāo)準(zhǔn)曲線,其相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。

2結(jié)果

2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞中TLR3、RIG-1、MDA5 、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組的TLR3、RIG-1、MDA5 、IFN-α、IFN-β、IRF-3 mRNA水平與健康對(duì)照組比較均降低。高病毒載量組與低病毒載量組比較，高病毒載量組均比低病毒載量組降低。見表1。

2.2各組PBMC中TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA的表達(dá)高病毒載量組和低病毒載量組的TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA 表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組，且高病毒載量組進(jìn)一步低于低病毒載量組。見圖1。

2.3病毒載量和mRNA的相關(guān)性分析實(shí)驗(yàn)組的TLR3、RIG-1、MDA5、 IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA水平，分別與HBV-DNA的含量(log copies/ml)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.697、-0.738、-0.867、-0.618、-0.415、-0.573)具有顯著性差異，P<0.05。見圖2。

圖1　RT-PCR檢測TLR3、RIG-1、MDA5 mRNA的表達(dá)Fig.1　TLR3，RIG-1，MDA5 mRNA expression detected by RT-PCRNote: 1.NC group；2 .Low virus load group；3.High virus load group.

GroupTLR3RIG-1MDA5IRF-3IFN-αIFN-βNCgroup(n=40)22.76±10.7829.01±8.9125.4±11.9833.16±14.1443.16±18.3439.16±18.17Lowvirusload(n=30)11.31±3.291)18.26±7.201)13.75±5.091)18.35±4.651)23.79±18.921)20.25±18.631)Highvirusload(n=24)6.34±3.052)9.40±4.992)6.68±3.242)12.37±6.552)18.35±8.632)12.88±6.052)

Note：1)P<0.05 compared with NC group;2)P<0.05 compared with Low virus load.

圖2　病毒載量和TLR3、RIG-1、MDA5、 IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA的相關(guān)性分析Fig.2　Correlation analysis among HBV-DNA and TLR3，RIG-1，MDA5， IFN-α，IFN-β，IRF-3 mRNA in all patients with CHB

圖3　用酶聯(lián)免疫法檢測的的血清中IFN-α、IFN-β的蛋白質(zhì)水平Fig.3　Protein level of IFN-α and IFN-β in serum by ELISANote: P<0.05.

2.4干擾素的蛋白水平

2.4.1IFN-α的蛋白含量IFN-α的蛋白含量在慢性乙型肝炎患者中的表達(dá)降低，實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)的平均測定濃度為22.76 pg/ml，SD為4.71。而正常對(duì)照組的平均測定濃度為145 pg/ml，SD為20.01。實(shí)驗(yàn)組平均值比正常對(duì)照組平均值低6.37倍，表達(dá)水平明顯降低。兩組數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，t=3.264,P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

2.4.2IFN-β的蛋白含量IFN-β的實(shí)驗(yàn)組蛋白平均測定濃度為3.96 pg/ml，SD為1.57，正常實(shí)驗(yàn)對(duì)照組平均濃度為31.34 pg/ml，SD為3.62，IFN-β蛋白質(zhì)水平在慢性乙肝患者體內(nèi)表達(dá)明顯降低。兩組數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，t=4.023,P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖3。

3討論

乙型肝炎病毒(HBV)是一種隱形病毒，侵染肝細(xì)胞后，能夠干擾肝細(xì)胞正常的新陳代謝，如HBV破壞肝細(xì)胞的線粒體，HBV在肝細(xì)胞內(nèi)增殖活躍進(jìn)而造成肝細(xì)胞破損，呈現(xiàn)慢性炎癥急性發(fā)作或慢性炎癥持續(xù)存在的表現(xiàn)[6]。

到目前為止，人類已發(fā)現(xiàn)的Toll樣受體(TLR)有13種[7]，分別命名為TLR1-TLR13，TLR可通過識(shí)別病原相關(guān)的分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)，引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起重要作用，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)，是連接天然免疫和獲得性免疫的重要橋梁。其中只有TLR 3與病毒感染有關(guān)，是通過IRF3信號(hào)通路分泌干擾素的[8]。

RIG-I和MDA5屬于同源 RNA 螺旋酶，均可識(shí)別病毒來源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)，并且具有識(shí)別不同病毒入侵的功能[9]。MDA5和 RIG-I是兩個(gè)細(xì)胞漿內(nèi)極其重要的抗病毒分子,可識(shí)別病毒相關(guān)的分子模式，從而介導(dǎo)機(jī)體抗病毒天然免疫應(yīng)答[10]。當(dāng)病毒感染時(shí)，細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生dsRNA ,MDA5和 RIG-I均可以通過識(shí)別dsRNA 進(jìn)而激活 NF-κB 和干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory Factor 3,IRF3)[11],從而誘導(dǎo)具有抗病毒作用Ⅰ型干擾素的生成。IRF-3存在于細(xì)胞質(zhì)溶膠中，是調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)產(chǎn)生的最重要的轉(zhuǎn)錄因子，且它能有效激活I(lǐng)FN-α和IFN-β基因[12]，干擾素具有廣譜抗病毒和免疫調(diào)節(jié)兩方面的作用，可抑制病毒DNA復(fù)制和RNA合成，促進(jìn)病毒RNA降解，抑制病毒蛋白的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)及病毒顆粒的成熟和分泌等[13]。因此RIG-I和MDA5也能激活Ⅰ型干擾素的合成。與Toll樣受體不同，RIG樣螺旋體是胞質(zhì)可溶性蛋白，可以直接或間接識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病原體及其產(chǎn)物，RIG-I信號(hào)通路的活化能夠促進(jìn)干擾素的產(chǎn)生，而干擾素又能夠進(jìn)一步的促進(jìn)RIG-I的表達(dá)，從而形成一個(gè)正反饋過程[14]。考慮到病毒生活史的大部分時(shí)間均發(fā)生于細(xì)胞漿內(nèi)[15]，因此胞質(zhì)模式識(shí)別受體在啟動(dòng)病毒感染誘發(fā)的Ⅰ型干擾素誘生中可能發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性乙肝患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中模式識(shí)別受體(TLR3、MDA5、RIG-I)、IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA 水平均降低，且均明顯低于健康對(duì)照組(P<0.05)。高病毒載量組又低于低病毒載量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高病毒載量患者體內(nèi)的數(shù)值明顯低于低病毒載量患者，可能是因?yàn)镠BV抑制了模式識(shí)別受體的作用，導(dǎo)致HBV逃逸機(jī)體的天然免疫，這可能是HBV感染慢性化的發(fā)病機(jī)制之一。與趙鋼德等[16]研究結(jié)果一致。TLR3 mRNA低表達(dá)可能是由于乙肝病毒侵入機(jī)體后，其DNA整合到宿主肝細(xì)胞內(nèi)，不表達(dá)或是低表達(dá)PAMPs，抑制機(jī)體的TLR3的表達(dá)，使其不能發(fā)揮作用，不能清除或是不能完全清除乙肝病毒。與周蘭英等[17]的報(bào)道基本一致。實(shí)驗(yàn)組的TLR3、RIG-1、MDA5、IFN-α、IFN-β和IRF-3 mRNA水平，分別與HBV-DNA的含量呈負(fù)相關(guān)具有顯著性差異，P<0.05。

我們考察了干擾素在血清中的蛋白表達(dá)的水平情況，實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組中的水平與其mRNA 水平一致，表明mRNA的表達(dá)水平具有代表性；結(jié)果提示模式識(shí)別受體可能在乙肝炎癥發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，調(diào)節(jié)模式識(shí)別受體的水平可能成為乙型肝炎治療的一條新途徑。

目前病毒性肝炎抗病毒治療的主要措施就是使用干擾素，胞膜和胞質(zhì)模式識(shí)別受體在抗HBV感染的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，因此，針對(duì)PRRs信號(hào)通路中某些環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，調(diào)節(jié)PRRs表達(dá)水平控制HBV感染，可能成為新的抗病毒策略。同時(shí)，一些新信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)可能為我們提供治療靶點(diǎn)。

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[收稿2015-07-04修回2015-07-20]

(編輯許四平)

Expression level of pattern recognition receptors TLR3,RIG-I and MDA5 in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B

MUNa，F(xiàn)ANXiu-Hong,GUOLian-Feng,LINing,ZENGRui-Hong.

ClinicalLabratoryDepartment,HarrisonIntornationalPeaceHospital,Hengshui053000,China

[Abstract]Objective:To investigate the expression of the PRRs in the cytomembrane and cytoplasm in the peripheral blood of patients with CHB.Methods: 54 patients with the CHB were the experimental group，while 40 healthy persons served as the control group.Anti-coagulant fresh blood on an empty stomach was drawed from both experimental groups and control group.The mononuclear cells were separated.RNA of mononuclear cells was extracted and reverse transcribed into cDNA.The relative mRNA expression of TLR3,RIG-I,MDA5,IFN-α,IFN-β and IRF-3 was detected with real-time quantitative PCR.Results: The relative mRNA expression of TLR3,RIG-1,MDA5,IFN-α,IFN-β and IRF-3 of the two experimental groups were significantly lower than that in control group (P<0.05).The relative mRNA levels of these moleculars in the experimental group with high virus load was lower significantly than those in the experimental group with low virus load .The levels of TLR3，RIG-I，MDA5，IFN-α，IFN-β，IRF-3 expression have negative correlation to loads of HBV(r=-0.697，-0.738，-0.867，-0.618，-0.415，-0.573).Conclusion: The mRNA expression levels of the PRRs (TLR3,RIG-1 and MDA5) in the peripheral blood mononuclear cells of the patients with CHB were significantly decreased.May be associated with chronic HBV infection status.

[Key words]Chronic hepatitis B;TLR3;RIG-1；MDA5;IFN-α；IFN-β；IRF-3

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.025

作者簡介：牟娜(1982年-)，女，碩士，主要從事HBV感染和免疫方面研究。通訊作者及指導(dǎo)教師：曾瑞紅(1970年-)，女，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事基礎(chǔ)免疫學(xué)研究，E-mail:zengruihong1970@sina.com。

中圖分類號(hào)R392.12

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0715-05

①本文為河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目(12966117D)。

②衡水市景縣人民醫(yī)院，衡水053000。

③河北醫(yī)科大學(xué)免疫教研組，石家莊050000。