劉　芬　侯　?！≠M巧玲　高　源　蔡潤蘭　陶燕蓉　王崢濤　齊　云

(中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所藥理毒理中心,北京100193)

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全蝎水提物對巨噬細胞活化作用研究①

劉芬侯睿費巧玲高源蔡潤蘭陶燕蓉②王崢濤③齊云

(中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所藥理毒理中心,北京100193)

[摘要]目的：觀察全蝎水提物(Buthus martensii water extract，BMWE)在體外對小鼠巨噬細胞株RAW264.7的活化作用。方法：MTT法測定細胞活性；采用FITC標記的酵母測定吞噬活性；利用Griess試劑和ELISA方法測定細胞上清NO、TNF-α和IL-6釋放量。結果：BMWE在不影響細胞活力的劑量范圍內可增強正常及免疫抑制的RAW264.7細胞吞噬熒光酵母能力(P<0.01)，增加RAW264.7細胞NO釋放量(P<0.01)，促進RAW264.7細胞TNF-α和IL-6產生(P<0.01)，均具有良好的量效關系。結論：BMWE可明顯提高巨噬細胞吞噬功能與分泌能力，活化巨噬細胞，此作用與全蝎傳統(tǒng)用于治療瘡瘍、瘰疬，現(xiàn)代用于腫瘤的臨床應用相關。

[關鍵詞]全蝎水提物；巨噬細胞；吞噬活性；一氧化氮；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

全蝎為節(jié)肢動物門蛛形綱鉗蝎科東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥全體，性平，味辛，具有息風止痙、攻毒散結、通絡止痛的功效，常用于驚厥、破傷風痙攣、瘡瘍腫毒、瘰疬結核、風濕痹痛等癥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)全蝎具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗凝、抗血栓、抗哮喘、抗腫瘤、抗癌等作用[1,2]。

巨噬細胞作為一種具有可塑性和多能性的細胞群體，在體內不同的微環(huán)境影響下，受到不同異物或細胞因子的刺激，從而被活化[3]。在炎癥反應初期階段，巨噬細胞活化主要表現(xiàn)為吞噬功能增強，一些調節(jié)免疫應答的細胞因子(NO、TNF-α等)合成及分泌適量增加[4,5]，以此對入侵的病原微生物或腫瘤細胞等發(fā)揮吞噬或細胞毒作用，積極調節(jié)機體免疫在一個可控的范圍內發(fā)展。傳統(tǒng)中醫(yī)將全蝎用治瘡瘍腫毒、瘰疬結核，現(xiàn)代常用于腫瘤。有報道巴西鉗蝎的毒液和毒素(Ts1、Ts6)能夠增加巨噬細胞炎癥介質釋放，促巨噬細胞的活化[6]，東亞鉗蝎蝎毒多肽能夠通過增加Beclin1、MAP1LC3A的蛋白表達，促進自噬的發(fā)生，從而對S180肉瘤細胞產生自噬性作用[7]。當然，巴西鉗蝎與東亞鉗蝎所屬物種有別，蟲體也不能與毒液或毒素等同(盡管蟲體中殘存蝎毒)。但這些信息使我們對全蝎是否也會影響巨噬細胞活化很感興趣。本文即是在此背景下進行了以下的研究。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器EVOS FL AUTO全自動熒光倒置顯微鏡、Multiskan Ascent酶標儀、Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL發(fā)光分析儀，美國Thermo Electron公司產品。BT125D電子天平，德國Sartorius產品。Napco5410型二氧化碳孵箱，美國NAPCO產品。XDS-1B倒置顯微鏡，重慶光電儀器公司。

1.1.2主要試劑地塞米松(Dex)、異硫氰酸熒光素(FITC)、脂多糖(LPS)均為Sigma公司產品。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基均為Gibco公司產品。IL-6和TNF-α檢測試劑盒為BioLegend產品。N-1-萘乙二胺二鹽酸鹽、磺胺，源自北京化學試劑公司。干酵母源自安琪酵母有限公司。其余均為國產分析純。

1.1.3實驗藥物全蝎水提物(BMWE)由上海中醫(yī)藥大學中藥研究所提供，經鑒定為東亞鉗蝎Buthus martensii karsch的干燥體。采用常規(guī)方法制備水煎劑，第一次10倍量水(w/w)，第二次8倍量水，沸騰開始計時，1 h/次，合并濾液，冷凍干燥。冷凍干燥后計算得率為28.7%。

1.1.4實驗用細胞株小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞源于美國ATCC公司。

1.2方法

1.2.1FITC與酵母偶聯(lián)按文獻[8]法取適量干酵母高壓滅活，磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解并洗滌三次，1 000 r/min離心10 min得到酵母沉淀物。以碳酸氫鹽緩沖液(CBS)重懸酵母沉淀物，顯微鏡下計數(shù)并調整酵母濃度為4×108個/ml，加入等體積的FITC溶液(100 μg/ml)，室溫下攪拌30 min。等量PBS洗滌酵母，離心，以含4%BSA的CBS重懸酵母,調節(jié)細胞濃度為4×108個/ml，室溫下攪拌15 min。先后以適量PBS、含4%BSA的PBS洗滌4次以除去游離FITC，1 000 r/min離心10 min得到偶聯(lián)酵母沉淀物。最后用適量PBS重懸酵母，凍干保存。

1.2.2BMWE對RAW264.7細胞活力的影響[9]細胞按1×105個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，加入不同濃度的BMWE(正常對照組加入等體積的培養(yǎng)基代替BMWE，本底孔以等體積培養(yǎng)基代體細胞懸液)，孵育20 h，每孔加入20 μl MTT，繼續(xù)孵育4 h后，傾去上清，加入100 μl DMSO，振蕩10 min，于540nm處測定OD值。按以下公式計算存活率:存活率%=(OD藥物-OD本底)/(OD正常-OD本底)×100%。

1.2.3熒光顯微鏡觀察BMWE對正常及免疫抑制RAW264.7細胞吞噬熒光酵母的影響[10]細胞按3×105個/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，400 μl/孔。貼壁后加無血清DMEM培養(yǎng)基400 μl/孔(免疫抑制組DMEM含10 μmol/L的Dex)，孵育2 h后，正常及Dex預處理(免疫抑制)細胞均加入100 μl不同濃度BMWE，陽性對照組加入100 μl終濃度為0.01 μg/ml的LPS，置孵箱中養(yǎng)24 h，吸棄上清，每孔加入500 μl帶熒光的酵母懸液(酵母∶巨噬細胞=40∶1)與細胞共培養(yǎng)2 h。每孔加入500 μl臺盼藍溶液(1.25 mg/ml，用D-hank′s液配制)，1 min以淬滅胞外熒光，馬上于全自動熒光顯微鏡下觀察細胞吞噬熒光酵母情況(放大倍數(shù)為800倍)。

1.2.4熒光酶標儀測定BMWE對正常及免疫抑制RAW264.7細胞吞噬熒光酵母的影響[10]細胞按1×105個/孔接種于96孔黑色細胞培養(yǎng)板中，100 μl/孔。貼壁后加無血清DMEM培養(yǎng)基100 μl/孔(免疫抑制組DMEM含10 μmol/L的Dex)，孵育2 h后，正常及Dex預處理(免疫抑制)細胞均加入100 μl不同濃度BMWE，陽性對照組加入100 μl終濃度為0.01 μg/ml的LPS，置孵箱中養(yǎng)24 h，棄上清，每孔加入100 μl帶熒光的酵母懸液(酵母∶巨噬細胞=40∶1)與細胞共培養(yǎng) 2 h。每孔加入200 μl臺盼藍溶液(1.25 mg/ml，用D-hank′s液配制)，1 min以淬滅胞外熒光。D-hank′s液洗細胞2次，每孔加入200 μl D-hank′s液，在熒光酶標儀λex485，λem538 nm處測定熒光強度。

1.2.5BMWE對RAW264.7細胞NO、TNF-α和IL-6釋放的影響[11]細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后加入不同濃度的BMWE(正常和陽性對照加入等體積的培養(yǎng)基或LPS)，孵育24 h，Griess法測定上清中NO2-的含量，用以反映NO分泌水平[12]；參照ELISA試劑盒說明書測定上清液中TNF-α和IL-6的含量。

2結果

2.1BMWE對RAW264.7細胞活力的影響當BMWE使用劑量為400 μg/ml時，能顯著抑制細胞增殖，抑制率為35%(P<0.01)；而當劑量≤200 μg/ml時，BMWE對細胞活力無顯著影響(見圖1)，故本研究的使用劑量均在200 μg/ml以下。

2.2BMWE對正常及免疫抑制巨噬細胞吞噬功能的影響

2.2.1BMWE對正常RAW264.7細胞吞噬功能的影響如圖2、3所示，以測得正常細胞的熒光值為相對值1，6.25 μg/ml BMWE作用下的細胞相對熒光值約為1.7，且具有統(tǒng)計學差異。因此，6.25 μg/ml 的BMWE可明顯提高RAW264.7細胞對酵母的吞噬能力，且隨劑量增高，作用增強，在6.25～50 μg/ml 劑量范圍內顯示良好的線性關系。

2.2.2BMWE對免疫抑制RAW264.7細胞吞噬功能的影響免疫抑制處理后，RAW264.7細胞吞噬酵母的能力明顯降低(見圖4)，相對熒光值降為約0.4，與正常細胞比具有顯著性差異(P<0.01)。濃度為6.25 μg/ml 時相對熒光值接近1，且隨劑量增高，相對熒光值增加，在6.25～50 μg/ml 劑量范圍內顯示良好的線性關系(見圖5)。由此可見，BMWE可明顯提高免疫抑制RAW264.7細胞對酵母的吞噬能力。

圖1　BMWE對RAW264.7細胞活力的影響Fig.1　Effect of BMWE on RAW264.7 cells viabilityNote: *.P<0.01,compared with normal control group.

圖2　熒光酶標儀測定BMWE對正常RAW264.7 細胞吞噬熒光酵母的影響Fig.2　Effect of phagocytic activity of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.05,compared with LPS group.

圖3　熒光顯微鏡觀察BMWE對正常RAW264.7 細胞吞噬熒光酵母的影響Fig.3　Effect of phagocytic activity of RAW264.7 cells induced by BMWENote: A.Normal control group；B.12.5 μg/ml BWME group；C.100 μg/ml BMWE group；D.LPS group.

圖4　熒光酶標儀測定BMWE對免疫抑制RAW264.7 細胞吞噬熒光酵母的影響Fig.4　Effect of phagocytic activity of immune inhibition RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with Dex group;#.P<0.05,compared with LPS+Dex group.

圖5　熒光顯微鏡觀察BMWE對免疫抑制RAW264.7 細胞吞噬熒光酵母的影響Fig.5　Effect of phagocytic activity of immune inhibition RAW264.7 cells induced by BMWENote: A.DEX group；B.DEX+12.5 μg/ml BMWE group；C.DEX+100 μg/ml BWME group；D.DEX+LPS group.

圖6　BMWE對RAW264.7 細胞釋放NO的影響Fig.6　Effect of NO production of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.01,compared with LPS group.

圖7　BMWE對RAW264.7 細胞釋放TNF-α的影響Fig.7　Effect of TNF-α production of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.01,compared with LPS group.

2.3BMWE對RAW264.7細胞NO、IL-6和TNF-α釋放的影響從圖6～8中可以看到，BMWE在終濃度25～100 μg/ml均可明顯促進RAW264.7細胞對NO、IL-6和TNF-α的分泌，且呈現(xiàn)出良好的量效關系。同時，我們也注意到，BMWE對三種因子的促分泌作用上存在不同的敏感性，這種差異性可能正是其臨床應用于不同適應癥時療效優(yōu)劣不一的原因之一。

圖8　BMWE對RAW264.7 細胞釋放IL-6的影響Fig.8　Effect of IL-6 production of RAW264.7 cells induced by BMWENote: *.P<0.01,compared with normal control group;#.P<0.01,compared with LPS group.

3討論

目前，國外學者對蝎的研究主要集中于蝎毒液和蝎毒的藥理作用研究上，巴西鉗蝎的毒液能夠促進巨噬細胞NO、IL-6、TNF-α、IFN-γ、H2O2的產生，毒素(Ts1、Ts6)能夠增加巨噬細胞上清NO、IL-6、TNF-α含量，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物和腫瘤細胞，調節(jié)機體免疫功能[6,13，14]。全蝎在免疫調節(jié)方面是否與其報道的毒液有相似之處，這是一個值得研究的問題。中醫(yī)臨床傳統(tǒng)將全蝎用于治療瘡瘍、瘰疬而現(xiàn)代全蝎在抗腫瘤上的運用[2,15]，都提示蟲體可能有類似其所含毒液的促巨噬細胞活化的作用。通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，全蝎水提物(BMWE)能增強正常或免疫抑制的巨噬細胞吞噬能力,促進細胞分泌細胞因子，活化巨噬細胞?；罨木奘杉毎粌H能吞噬侵入機體的病原微生物還能吞噬機體本身凋亡細胞及腫瘤細胞[3]。因此，這對于炎癥早期病原微生物的清除和發(fā)病初期腫瘤細胞轉歸具有有益作用[16]。在促分泌上，實驗顯示全蝎水提物能促進巨噬細胞釋放TNF-α、NO及IL-6炎癥介質。我們知道，TNF-α具有免疫調節(jié)作用，能促進樹突狀細胞成熟及T細胞增殖和激活，上調IL-12、IL-1、趨化因子受體等的表達[17]，同時TNF-α是迄今為止抗癌活性最強的因子，不僅能增強宿主免疫力還能誘導腫瘤細胞凋亡。NO的作用之一就是增強巨噬細胞對抗病毒、真菌、細菌、腫瘤細胞等作用。IL-6不僅能促進細胞增殖、分化、免疫防御機制增強等，還能通過干預細胞的黏附性和活動力、腫瘤特異性抗原的表達及腫瘤細胞的增殖從而影響腫瘤的生長。對巨噬細胞吞噬能力的判斷可通過直接測定吞噬物或采用間接的方法，由于巨噬細胞吞噬微生物后會影響微生物細胞活力[18]或自身產生活性氧(H2O2、O2-、OH-)[19]，因此可以通過測定細胞的活力或胞內活性氧等來間接反映巨噬細胞的吞噬能力。而常用的直接法如吞噬紅細胞[20]或中性紅[21]等可直接通過鏡下計數(shù)紅細胞或比色法判斷其吞噬量的多少。近年來，有人采用熒光微球[22]、熒光素標記的大腸桿菌[23,24]等為吞噬物，以流式細胞儀對巨噬細胞內標記物進行檢測。然而吞噬異種紅細胞或中性紅的方法與實際病理情況差異較大，且檢測靈敏度不高；流式儀測定又受限制于研究者單位的硬件條件。在本實驗中，我們以自制FITC標記酵母與巨噬細胞共同孵育，再以熒光光度計檢測巨噬細胞對酵母的吞噬情況，該法具有簡便、靈敏、準確且對儀器條件要求不高的優(yōu)勢[25]。通過此法，我們發(fā)現(xiàn)BMWE具有較好的促巨噬細胞吞噬能力的作用。事實上，有學者以全蝎連續(xù)灌胃小鼠7 d發(fā)現(xiàn)其腹腔巨噬細胞在吞噬雞紅細胞能力上顯著提高[26]，這一體內實驗結果與我們的體外研究結果是一致的。

綜上，我們認為全蝎的這種增強正常及免疫抑制巨噬細胞吞噬能力和促正常巨噬細胞NO、TNF-α、IL-6分泌的作用有助于巨噬細胞吞噬微生物或腫瘤凋亡細胞，也有助于機體對抗異物入侵和抗腫瘤。這些作用可能是傳統(tǒng)中醫(yī)用于治療瘡瘍、瘰疬，現(xiàn)代用治腫瘤的藥理學基礎。

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[收稿2015-09-01修回2015-11-27]

(編輯張曉舟)

Studies on macrophage activations of BMWE in vitro

LIUFen,HOURui,FEIQiao-Ling,GAOYuan,CAIRun-Lan,TAOYan-Rong,WANGZheng-Tao,QIYun.

InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100193,China

[Abstract]Objective:To investigate the activation effect of Buthus martensii water extract(BMWE)in RAW 264.7 cells.Methods: The MTT assay and FITC-conjugated yeast were used to evaluate the effects of BMWE on the viability and phagocytosis of RAW264.7 cells,respectively.NO production in supernatant was measured by Griess reagent.IL-6 and TNF-α production of the cells induced by BMWE were measured by ELISA.Results: Cell viability analysis showed that BMWE did not affect the cell viability up to a concentration of 200 μg/ml.Pretreatment with BMWE potently enhanced phagocytic function(P<0.01)in the presence or absence of dexamethasone in RAW 264.7 cells.BMWE also significantly increased NO,TNF-α and IL-6 production(P<0.01)in a dose-dependent manner.Conclusion: BMWE can activate the macrophages showing that the phagocytosis and secretion function were markedly enhanced.

[Key words]BMWE;Macrophages;Phagocytosis;NO;IL-6;TNF-α

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.013

作者簡介：劉芬(1987年-)，女，在讀碩士，主要從事抗炎與免疫藥理學研究。通訊作者及指導教師：齊云(1964年-)，男，博士，研究員，主要從事抗炎與免疫藥理學研究，E-mail: yqi@implad.ac.cn。

中圖分類號R392.12

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)05-0660-05

·中醫(yī)中藥與免疫·

①本文受國家科技重大專項(2014ZX09201022-006、2012ZX09301-002-001)及北京自然科學基金項目(7142112)資助。

②北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京100029。

③上海中醫(yī)藥大學中藥研究所，上海201203。