劉越峰　羅衛(wèi)民　張　勇　鐘曉東

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院眼科中心，十堰442000)

?

DHA激活NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)HO-1①

劉越峰羅衛(wèi)民②張勇鐘曉東

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院眼科中心，十堰442000)

[摘要]目的：觀察二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶(Heme oxygenase，HO)-1的分子機(jī)制。方法：培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19，加入30～100 μmol/L DHA作用4～24 h。Western blot檢測(cè)HO-1的表達(dá)及NADPH氧化酶p47phox亞基的磷酸化；熒光探針H2DCFDA檢測(cè)活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生；免疫熒光分析Nrf2在細(xì)胞核及胞漿中的表達(dá)；最后采用NADPH氧化酶抑制劑DPI，ROS抑制劑NAC或采用siRNA干擾Nrf2表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)HO-1表達(dá)的影響。結(jié)果： 100 μmol/L DHA作用ARPE-19細(xì)胞30 min即可誘導(dǎo)p47phox亞基的磷酸化，同時(shí)能增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量；采用NADPH氧化酶抑制劑DPI處理后，ROS水平顯著降低；免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示DHA作用細(xì)胞2 h后，可誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位，采用DPI或NAC處理后，Nrf2核轉(zhuǎn)位水平明顯減少；采用Nrf2 siRNA沉默其表達(dá)，或采用DPI或NAC處理后，可抑制DHA誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)HO-1。結(jié)論：DHA可能通過(guò)NADPH氧化酶/ROS/Nrf2通路途徑誘導(dǎo)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)HO-1，從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]二十二碳六烯酸；視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；血紅素氧合酶-1

年齡相關(guān)性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)是一種以進(jìn)行性視網(wǎng)膜黃斑部退行性病變?yōu)樘卣鞯难鄣准膊?，好發(fā)于45歲人群，并隨年齡增長(zhǎng)有關(guān)，是常見的不可逆性致盲眼病之一[1,2]。目前認(rèn)為，AMD是一種與遺傳以及環(huán)境因素相關(guān)的因素疾病[3]。近年來(lái)的觀點(diǎn)認(rèn)為，氧化應(yīng)激是多種AMD危險(xiǎn)因素致病機(jī)制中的重要組成部分。由于黃斑部解剖學(xué)與組織學(xué)的特殊性，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感：持續(xù)暴露于光照之下所積累的光氧化效應(yīng)，以及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬光感受器外節(jié)盤膜后，細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生大量活性氧類(Reactive oxygen species，ROS)。此外，隨著年齡的增長(zhǎng)，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞清除ROS的能力有所降低。在AMD發(fā)生的整個(gè)階段，由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與光感受器之間存在營(yíng)養(yǎng)代謝等多方面的相互作用，因而它是AMD病變的中心環(huán)節(jié)。因此針對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及保護(hù)的研究，對(duì)探討其致病機(jī)理以及臨床治療具有重要意義。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA) 是一種不飽和脂肪酸，它對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及視網(wǎng)膜光感受細(xì)胞的發(fā)育及其功能具有重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，DHA可有效改善光損傷所致的視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能上調(diào)內(nèi)源性抗氧化蛋白的表達(dá)[4,5]。本研究旨在探討DHA對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞表達(dá)血紅素氧合酶(Heme oxygenase，HO)-1的影響及分子機(jī)制，從而為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑ARPE-19細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。DMEM培養(yǎng)基、無(wú)內(nèi)毒素胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco；DHA、β-actin多克隆抗體、NADPH氧化酶抑制劑DPI、ROS抑制劑NAC以及熒光探針H2DCFDA為Sigma-Aldrich產(chǎn)品。p-p47phox以及鼠抗人total-p47phox購(gòu)自Cell Signaling?？笻O-1多克隆抗體、Nrf2多克隆抗體和兔抗鼠二抗購(gòu)自Santa Cruz。Nrf2 siRNA由廣州RiboBio公司合成，siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Qiagen。細(xì)胞蛋白提取試劑盒和Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑為Pierce產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理ARPE-19細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清L-谷氨酰胺和抗生素)，置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80%時(shí)，消化、換液并接種至6孔板中，并改用含1%血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。隨后細(xì)胞加入不同濃度的DHA作用4～24 h，提取蛋白用于下一步研究。

1.2.2細(xì)胞蛋白提取與Western blotARPE-19細(xì)胞經(jīng)DHA處理結(jié)束后，用4℃無(wú)菌PBS漂洗1次，加入含蛋白酶抑制劑的Cocktails裂解細(xì)胞。胞漿蛋白的提取按照Pierce公司試劑盒(NE-PER Nuclear & Cytoplasmic Extraction Reagents KIT)提供的操作步驟進(jìn)行。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。并獲取20 μl蛋白用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后采用半干轉(zhuǎn)印方法將其轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。纖維素膜用5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，隨后分別用相應(yīng)的一抗和二抗孵育，ECL顯影、拍照。

1.2.3ROS測(cè)定ARPE-19細(xì)胞處理完畢后，加入分子探針染液H2DCFDA(終濃度5 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。經(jīng)PBS充分洗滌后，在熒光分光光度計(jì)(Infinite F200 Pro，TECAN)上設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度(Fluorescence intensity)，并計(jì)算熒光的相對(duì)值，計(jì)算公式：處理組熒光強(qiáng)度/對(duì)照組熒光強(qiáng)度×100%(Relative intensity)。

1.2.4免疫熒光觀察Nrf2核轉(zhuǎn)位生長(zhǎng)于蓋玻片上的ARPE-19細(xì)胞處理完畢后，用3.5%多聚甲醛重懸浮細(xì)胞，室溫固定15 min。經(jīng)甲醇通透10 min并經(jīng)無(wú)菌PBS洗滌后，滴加1%羊血清至蓋玻片上室溫封閉30 min。隨后PBS洗滌3次，并加入抗Nrf2抗體室溫孵育2 h。洗滌后繼續(xù)加入C3標(biāo)記羊抗鼠二抗孵育1 h。激光共聚焦顯微鏡拍照(Nikon C2 Plus)。

1.2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)于培養(yǎng)皿中(約5×105)中的ARPE-19細(xì)胞更換為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18～24 h。siRNA的轉(zhuǎn)染按照Qiagen提供的步驟進(jìn)行。即100 nmol/L Nrf2 siRNA或?qū)φ誷iRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合后，加至細(xì)胞培養(yǎng)液中。4 h后用無(wú)菌PBS漂洗細(xì)胞，并將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為完全培養(yǎng)基，隨后加入DHA孵育后用于下一步研究。

2結(jié)果

2.1DHA誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中NADPH氧化酶p47phox亞基磷酸化未經(jīng)DHA處理的空白對(duì)照組細(xì)胞中p47phox磷酸化水平極低，當(dāng)采用100 μmol/L DHA孵育10 min后，可明顯上調(diào)細(xì)胞內(nèi)磷酸化p47phox水平，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，磷酸化水平逐漸增多，1 h后達(dá)到峰值，而總p47phox含量保持不變(圖1)。

圖1　DHA誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞p47phox亞基磷酸化Fig.1　DHA induces p47phox subunit phosphorylation in ARPE-19 cells

圖2　DHA與DPI對(duì)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響Fig.2　Effect of DHA and DPI on production of ROS in ARPE-19 cellsNote: *.P<0.05,as compared with control (0 μmol/L DHA);#.P<0.05,as compared with 0 μmol/L DHA.

圖3　DPI、NAC對(duì)DHA誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響Fig.3　Effect of DPI,NAC and DHA on nuclear translocation of Nrf2

2.2DHA經(jīng)NADPH氧化酶誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生30～100 μmol/L DHA處理ARPE-19細(xì)胞4 h后，可有效增加細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。而細(xì)胞在DHA處理前給予10 μmol/L DPI預(yù)處理1 h，結(jié)果顯示ROS含量明顯降低(圖2)。

2.3DHA經(jīng)ROS激活Nrf2ARPE-19細(xì)胞在DHA處理前，Nrf2位于細(xì)胞漿中。經(jīng)100 μmol/L DHA處理4 h后，細(xì)胞核中Nrf2顯著增多。而ARPE-19首先用10 μmol/L DPI或10 mmol/L NAC預(yù)處理1 h后，可顯著抑制DHA誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位(圖3)。

2.4DHA上調(diào)ARPE-19細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)未刺激時(shí)，ARPE-19細(xì)胞內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)水平很低。采用30、50和100 μmol/L DHA刺激18 h后，HO-1蛋白表達(dá)水平隨著DHA濃度的增高而遞增(圖4)。

圖4　DHA上調(diào)ARPE-19細(xì)胞表達(dá)HO-1蛋白Fig.4　DHA induces HO-1 expression in ARPE-19 cells

圖5　DPI、NAC或Nrf2 siRNA對(duì)DHA誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的影響Fig.5　Effect of DPI,NAC and Nrf2 siRNA on DHA-induced HO-1 expressionNote: A.DPI and NAC on DHA induced HO-1 expression;B.Effect of Nrf2 siRNA on DHA-induced HO-1 expression.

2.5DHA誘導(dǎo)HO-1產(chǎn)生與NADPH氧化酶/ROS/Nrf2有關(guān)ARPE-19細(xì)胞在DHA處理前，HO-1表達(dá)量極低。經(jīng)100 μmol/L DHA處理18 h后，細(xì)胞中HO-1表達(dá)顯著增多。而ARPE-19首先用10 μmol/L DPI或10 mmol/L NAC預(yù)處理1 h后，可顯著抑制DHA誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。此外，采用siRNA干擾Nrf2表達(dá)后，HO-1表達(dá)水平也顯著減少(圖5)。

3討論

AMD是與衰老密切相關(guān)的一種疾病，長(zhǎng)期以來(lái)，氧自由基學(xué)說(shuō)占有十分重要的地位。各種活性氧的產(chǎn)生所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在多種年齡相關(guān)性疾病如白內(nèi)障、Parkinson病、Alzheimer病中與AMD具有類似的病理生理特征。有研究表明，給予抗氧化制劑后，可有效改善視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞功能，而這一過(guò)程與上調(diào)HO-1的表達(dá)有關(guān)。HO是降解血紅素代謝為CO、Fe2+和膽綠素的限速酶。生理?xiàng)l件下，HO共有三種同工酶，即HO-1、HO-2和HO-3，其中僅HO-1為誘導(dǎo)型。多種病理生理狀態(tài)，如氧化應(yīng)激、感染、糖尿病和視網(wǎng)膜病變等因素均可上調(diào)其表達(dá)[6]。HO-1可通過(guò)其產(chǎn)物CO、膽紅素和Fe2+而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，包括降低TNF-α的促凋亡毒性[7]，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能，減輕炎癥和氧化應(yīng)激損傷[8]。

研究表明，HO-1的表達(dá)受多種激酶和核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。NADPH氧化酶也稱NOX，是由質(zhì)膜結(jié)合成分和胞漿成分組成的一個(gè)多酶復(fù)合體，其中胞漿部分主要由p47phox、p67phox、p40phox、Rac2、Cdc42等組成。多種外源性因素可誘導(dǎo)p47phox磷酸化，后者隨后由胞漿轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜，從而組裝成有具有完整功能的NADPH氧化酶。因此可通過(guò)檢測(cè)p47phox的磷酸化水平間接判斷NADPH氧化酶的激活[9]。隨后NADPH 氧化酶可通過(guò)一系列電子傳遞催化ROS的生成，包括O2·、H2O2、HO·、NO·等。盡管ROS的過(guò)度產(chǎn)生可引起細(xì)胞大分子如蛋白質(zhì)、DNA的氧化損傷，但適量的ROS也是細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子[10]。有研究顯示，多種因素所致的HO-1表達(dá)與ROS有關(guān)[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，DHA處理后，可明顯誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生ROS。而采用NADPH氧化酶抑制劑DPI處理后，ROS產(chǎn)生顯著降低。而同時(shí)采用ROS清除劑NAC處理后，HO-1表達(dá)顯著減少，這表明HO-1的表達(dá)受NADPH氧化酶/ROS的調(diào)控。

Nrf2是一種重要的氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄保護(hù)因子。生理?xiàng)l件下Nrf2存在于胞漿中，并與胞漿中抑制蛋白Keap1相結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到各種外源性刺激時(shí)，Keap1經(jīng)泛素化降解而促使其與Nrf2分離。Nrf2隨后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與基因 5′非編碼區(qū)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)性元件(Antioxidant response element，ARE)相結(jié)合而啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。本研究也發(fā)現(xiàn)DHA處理后，Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)而調(diào)控HO-1的表達(dá)。此外，通過(guò)采用DPI或NAC處理后，Nrf2的核轉(zhuǎn)位受到明顯抑制，這表明Nrf2的激活與NADPH氧化酶/ROS有關(guān)。同時(shí)，采用Nrf2 siRNA沉默后發(fā)現(xiàn)，HO-1的表達(dá)顯著減少，這表明HO-1的表達(dá)最終受ROS/Nrf2的調(diào)控。

總之，本研究證實(shí)DHA通過(guò)激活NADPH氧化酶/ROS信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，HO-1可能通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮對(duì)氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用。但由于參與調(diào)控HO-1表達(dá)的激酶眾多，如PI3K/Akt，蛋白激酶C等，這一切還有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]French DD,Margo CE.Age-related macular degeneration,anti-vascular endothelial growth factor agents,and short-term mortality:a postmarketing medication safety and surveillance study[J].Retina,2011,31(6):1036-1042.

[2]Seddon JM,Reynolds R,Maller J,etal.Prediction model for prevalence and incidence of advanced age-related macular degeneration based on genetic,demographic,and environmental variables[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2009,50(5):2044-2053.

[3]Hemminki K,Forsti A,Li X,etal.Familial risks of age-related macular degeneration[J].Am J Ophthalmol,2011,151(3):561-562.

[4]Ramchani-Ben OK,Cercy C,Amri M,etal.Dietary supplement enriched in antioxidants and omega-3 protects from progressive light-induced retinal degeneration[J].PLoS One,2015,10(6):e0128395.

[5]Johansson I,Monsen VT,Pettersen K,etal.The marine n-3 PUFA DHA evokes cytoprotection against oxidative stress and protein misfolding by inducing autophagy and NFE2L2 in human retinal pigment epithelial cells[J].Autophagy,2015，11(9)：1636-1657.

[6]Paine A,Eiz-Vesper B,Blasczyk R,etal.Signaling to heme oxygenase-1 and its anti-inflammatory therapeutic potential[J].Biochem Pharmacol,2010,80(12):1895-1903.

[7]Morse D,Pischke SE,Zhou Z,etal.Suppression of inflammatory cytokine production by carbon monoxide involves the JNK pathway and AP-1[J].J Biol Chem,2003,278(39):36993-36998.

[8]Florczyk U,Jazwa A,Maleszewska M,etal.Nrf2 regulates angiogenesis:effect on endothelial cells,bone marrow-derived proangiogenic cells and hind limb ischemia[J].Antioxid Redox Signal,2013,20(11):1693-1708.

[9]Pick E.Role of the Rho GTPase Rac in the activation of the phagocyte NADPH oxidase:outsourcing a key task[J].Small GTPases,2014,5:e27952.

[10]Hawkes HJ,Karlenius TC,Tonissen KF.Regulation of the human thioredoxin gene promoter and its key substrates:a study of functional and putative regulatory elements[J].Biochim Biophys Acta,2014,1840(1):303-314.

[11]Cui G,Luk SC,Li RA,etal.Cytoprotection of baicalein against oxidative stress-induced cardiomyocytes injury through the Nrf2/Keap1 pathway[J].J Cardiovasc Pharmacol,2015,65(1):39-46.

[12]Vriend J,Reiter RJ.The Keap1-Nrf2-antioxidant response element pathway:a review of its regulation by melatonin and the proteasome[J].Mol Cell Endocrinol,2015,401:213-220.

[收稿2015-09-20修回2015-11-17]

(編輯倪鵬)

Docosahexaenoic acid induces retinal pigment epithelial cells expression of heme oxygenase-1 by activation of NADPH oxidase/ROS/Nrf2

LIUYue-Feng,LUOWei-Min,ZHANGYong,ZHONGXiao-Dong.

DepartmentofOphthalmology,TaiheHospitalofShiyanAffiliatedtoHubeiUniversityofMedicine，Shiyan442000，China

[Abstract]Objective:To observe the molecular mechanism of Docosahexaenoic acid (DHA) on the expression of heme oxygenase (HO-1) in human retinal pigment epithelium cells.Methods: Human retinal pigment epithelium cell line ARPE-19 was cultured in vitro and was treated with 30-100 μmol/L DHA for 4-24 h.Phosphorylation of NADPH oxidase p47phoxsubunit was detected by Western blot.Production of reactive oxygen species (ROS) was detected by fluorescent probe.Activation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2) was detected by immunofluorescence.At last,DPI,an inhibitor of NADPH oxidase,NAC (ROS inhibitor),or Nrf2 siRNA was used to test their effect on HO-1 expression.Results: Treatment of ARPE-19 cells by 100 μmol/L DHA for 30 min could phosphorylate the p47phoxand increase the production of ROS.Preincubation of the NADPH oxidase inhibitor DPI significantly decrease the ROS level.Nuclear translocation of Nrf2 was also induced after DHA stimulation for 2 h,as demonstrated by immunofluorescence,DPI and NAC could inhibit the nuclear translocation of Nrf2.Transfection of Nrf2,or incubation of DPI and NAC could significantly abrogate DHA induced HO-1 expression.Conclusion: DHA protects retinal pigment epithelial cells against oxidative stress via NADPH oxidase/ROS/Nrf2 pathway.

[Key words]Docosahexaenoic acid;Retinal pigment epithelial cells;Heme oxygenase-1

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.05.009

作者簡(jiǎn)介：劉越峰(1978年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事眼底疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：liuyuefeng828@126.com。通訊作者及指導(dǎo)教師：羅衛(wèi)民(1978年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：weiminluo120@163.com。

中圖分類號(hào)R774.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)05-0644-04

①本文受十堰市科學(xué)技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目計(jì)劃(14Y40)資助。

②湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院心胸外科，十堰442000。