江　燕，朱小峰，閆福華

1.福建醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院口腔科，福州　350005；

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hVEGF基因修飾的SD大鼠BMSCs與膠原膜BME-10X復(fù)合物的成骨能力研究

江燕1，朱小峰1，閆福華2

1.福建醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院口腔科，福州350005；

摘要:目的觀察人血管內(nèi)皮生長因子(hVEGF165)基因的骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)與膠原膜BME-10X復(fù)合的相容性及該復(fù)合物移植在體內(nèi)的成骨情況，為其能否修復(fù)牙周骨質(zhì)缺損提供依據(jù)。 方法在體外將hVEGF165基因轉(zhuǎn)染的SD大鼠BMSCs種植于膠原膜BME-10X復(fù)合膜上，使用激光共聚焦掃描顯微鏡、熒光顯微鏡、掃描電鏡及組織學方法進行觀察，并將該復(fù)合物植入裸鼠皮下，于4、8周處死裸鼠取材制成組織切片，H-E染色后觀察異位體內(nèi)成骨和血管生成的情況。結(jié)果復(fù)合物培養(yǎng)24 h后見目的細胞在膠原膜中貼附、伸展，各層BME-10X膠原膜上均有數(shù)量不等的細胞附著。轉(zhuǎn)染細胞在膠原膜表面復(fù)層生長，并進入內(nèi)部間隙中。復(fù)合物植入裸鼠皮下后，可見新生膠原纖維、類骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)和新生血管的形成。結(jié)論hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs在膠原膜BME-10X上生長良好，細胞-膠原復(fù)合物在裸鼠體內(nèi)具有異位成骨及促進新生血管形成能力。

關(guān)鍵詞:人血管內(nèi)皮細胞； 骨髓基質(zhì)干細胞； 基因治療； 組織工程； 牙周組織再生； 膠原膜

牙周病所導(dǎo)致的牙周支持組織的破壞已成為門診拔牙的主要原因，而如何重建牙周新附著、恢復(fù)牙槽骨高度，進而根治牙周病是臨床急需解決的問題。近年來，國內(nèi)外的學者對骨形成蛋白-7(bone morphogenetic proteins-7，BMP-7)、血小板衍生因子-B(platelet-7 derived growth factor subunit B，PDGF-B)、堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor， b-FGF)作為目的基因構(gòu)建組織工程復(fù)合物修復(fù)牙周組織缺損進行了一系列的研究，證明基因工程與組織工程的聯(lián)合應(yīng)用為牙周骨質(zhì)重建提供了一個行之有效的方法[1-4]。骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是組織工程中理想的種子細胞，人血管內(nèi)皮生長因子(human vascularendothelial growth factor 165，hVEGF165)有強大的血管生成和骨再生作用[5]，并可以促進體外培養(yǎng)的BMSCs的增殖和分化[6]。本研究以hVEGF165基因轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs，將其種植于膠原膜BME-10X上構(gòu)建基因強化的組織工程復(fù)合物[7]，觀察兩者的相容性，進而在動物實驗?zāi)Ｐ?裸鼠)體內(nèi)觀察該復(fù)合物的異位成骨能力，為下一步將該復(fù)合物植入人體重建缺損的牙周組織提供實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物雄性清潔級SD大鼠12只，體質(zhì)量(130±20)g；6周齡BALB/c雄性裸鼠14只，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2007-0005。

1.1.2儀器與試劑DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜BME-10X(福建省博特生物科技有限公司)；熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Leica公司)；場發(fā)射掃描電鏡(美國FEI Nova Nano公司)。

1.2方法

1.2.1hVEGF165基因轉(zhuǎn)染BMSCs的獲得采用全骨髓法培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，取培養(yǎng)第3代的干細胞進行實驗[8]。用攜帶增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標志hVEGF165基因重組腺病毒載體(Ad5-hVEGF165-EGFP)轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs(形成的細胞簡稱為hVEGF165-BMSCs)[9]，MOI為100。

1.2.2hVEGF165-BMSCs與膠原膜BME-10X的復(fù)合將BEM-10X膜剪成4 mm×4 mm大小，充分吸收培養(yǎng)液DMED后放置于24孔板中，在每張膜中放入1×105個hVEGF165轉(zhuǎn)染的BMSCs，培養(yǎng)24 h，分別取等量復(fù)合體進行相關(guān)處理后用熒光倒置相差顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡及場發(fā)射掃描電鏡進行觀察，剩余復(fù)合體培養(yǎng)3 d后制備成石蠟切片，H-E染色后用生物顯微鏡進行組織學觀察。

1.2.3基因修飾的SD大鼠BMSCs與膠原膜BME-10X復(fù)合物體內(nèi)異位成骨實驗裸鼠14只隨機分為4組：A組：空白膜組；B組：BMSCs+膠原膜組；C組：空載體轉(zhuǎn)染BMSCs+膠原膜組；D組：hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs+膠原膜組。每組3只，另外2只備用。參照文獻[10]的方法將復(fù)合物植入大鼠體內(nèi)，于4，8周處死裸鼠，取背部標本，組織學切片觀察。

2結(jié)果

2.1基因修飾的SD大鼠BMSCs與膠原膜BME-10X復(fù)合情況的體外觀察

2.1.1復(fù)合物培養(yǎng)24 h的觀察

2.1.1.1倒置相差熒光顯微鏡觀察目的細胞發(fā)出綠色熒光，接種2 h后可在膠原膜上見部分圓形貼壁細胞，24 h細胞部分伸展開，并在膜邊緣呈纖維樣(圖1A)。

2.1.1.2激光共聚焦顯微鏡觀察各層BME-10X膠原膜均可見數(shù)量不等的發(fā)出綠色熒光的細胞附著(圖1B)。

2.1.1.3掃描電鏡觀察BME-10X膠原膜表面可見粗細不等的膠原纖維，內(nèi)部有大小不一的孔隙，表面及內(nèi)部均可見細胞生長，部分呈多角形。(圖1C)。

2.1.2復(fù)合物培養(yǎng)3 d的組織學觀察膠原膜表面細胞呈層狀生長，內(nèi)部孔隙中也有部分細胞長入(圖1D)。

2.2hVEGF165基因修飾的BMSCs與膠原膜BME-10X復(fù)合物裸鼠體內(nèi)異位成骨

2.2.1大體觀察所有裸鼠術(shù)后傷口愈合良好，植入物所在部位無免疫排斥反應(yīng)，存活至實驗結(jié)束。分別于植入4，8周后處死裸鼠：植入4周后各組植入物基本沒有吸收，表面纖維組織包繞，與皮下組織粘連；植入8周后膠原膜厚度有所減少，融合良好，可見B、C及D組標本有不同程度的降解吸收。

2.2.2組織學觀察

2.2.2.1植入4周后的組織學觀察A組膠原膜基本無降解，邊界清晰并被纖維組織包繞，材料內(nèi)部有少量散在的細胞和片狀新生膠原；B、C和D組可見膠原膜邊緣部分纖維溶解伴斷裂，出現(xiàn)降解吸收，整體體積變小，膜的兩側(cè)及中間出現(xiàn)大量長圓形或梭形細胞、塊狀的新生膠原組織及不規(guī)則條索狀未成熟的類骨樣基質(zhì)；D組還可見少量新生血管形成，管腔中可見紅細胞(圖2，箭頭處為血管)。

2.2.2.2植入8周后的組織學觀察A組膠原膜內(nèi)可見大量裸鼠自體細胞，部分區(qū)域可見神經(jīng)、肌肉及脂肪樣組織；B、C和D組的膠原膜兩側(cè)被降解吸收，原本的條索狀膠原支架明顯變薄、消失，逐漸被較多新生的膠原、呈網(wǎng)狀紅染的骨基質(zhì)、少量編織骨骨小梁及被覆其上的細胞所取代；D組還可見較多新生血管形成，管腔中可見紅細胞(圖3，箭頭處為血管)。

3討論

組織工程學自被提出后就引起了全世界各領(lǐng)域?qū)＜覍W者的廣泛關(guān)注，也日益廣泛地應(yīng)用于口腔醫(yī)學領(lǐng)域，特別是用于牙周組織的再生[11]。將體外培養(yǎng)的種子細胞種植于支架材料上，然后移植于牙周缺損區(qū)，細胞不斷增殖并分泌基質(zhì)的同時支架材料逐步降解，最終形成新的有功能活性的組織，從而有效促進了牙周組織缺損再生[12]。

除了種子細胞外，合適的支架材料也是構(gòu)建組織工程復(fù)合物的關(guān)鍵。理想的組織工程支架材料應(yīng)具備：良好的生物相容性、可吸收性、可塑性，表面微結(jié)構(gòu)利于細胞粘附生長，降解速度與細胞生長速度相適應(yīng)等特性。本實驗所用的支架材料為膠原膜BME-10X，為可吸收醫(yī)用組織引導(dǎo)再生膠原膜，主要成分為牛Ⅰ型膠原。筆者在早期研究中發(fā)現(xiàn)，該膠原膜不僅能維持骨髓基質(zhì)細胞的生長與增殖，而且能與轉(zhuǎn)染有目的基因BMP-7的BMSCs復(fù)合，同時人牙周膜成纖維細胞也可在該膠原膜上貼附、增殖，分泌大量的細胞外基質(zhì)，形成具有活性細胞及其基質(zhì)的膜樣組織，進而促進牙周組織再生[2,7,10,13]。在本研究中也觀察到：細胞-膜復(fù)合物培養(yǎng)24 h后，轉(zhuǎn)染hVEGF165后的SD大鼠BMSCs生長于膠原膜的表面與內(nèi)部；3 d后目的細胞在膠原膜表面呈復(fù)層生長的同時也能進入膜內(nèi)部孔隙中。由此可見，BME-10X膠原膜的生物相容性良好，可以為轉(zhuǎn)染hVEGF165的BMSCs提供一個安全的細胞粘附的微環(huán)境。

近年來，組織工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用于牙周組織的再生研究[2-4,14]。牙周組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，包括牙齦、牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)，其再生的最終目標是形成牙周新附著?？谇晃h(huán)境的特性決定了牙周再生過程不可能在絕對無菌的環(huán)境中進行，故血管化的組織工程物已經(jīng)漸漸成為醫(yī)學界關(guān)注的焦點[13]，為牙周再生提供了新的思路。建立一套完整的血管網(wǎng)，不僅能使組織工程復(fù)合物獲得周圍毛細血管網(wǎng)的營養(yǎng)支持，而且能使其內(nèi)部的細胞和基質(zhì)間有良好的信號傳遞，具有更強的抗感染能力，進行正常的新陳代謝，最終形成具有正常結(jié)構(gòu)和功能的組織。因此，血管化的組織工程復(fù)合物在口腔這一有菌的環(huán)境下能更好地重建牙周組織。劉伯齡等的研究表明，轉(zhuǎn)染hVEGF165基因的BMSCs能分泌有活性的VEGF蛋白[15]，而VEGF能提高成骨細胞活性，增強其遷移、增殖、分化并加速其骨形成[16-17]，并具有抗成骨細胞凋亡，維系成骨細胞的存活的作用[13]，而成骨細胞所分泌的堿性磷酸酶又顯著提高了BMSCs的成骨活性。在本實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)復(fù)合物植入4周時，hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs+膠原膜組復(fù)合物的體內(nèi)成骨能力與單純細胞-膜復(fù)合物及空載體-膜復(fù)合物的相似，但hVEGF165轉(zhuǎn)染BMSCs+膠原膜組還可見少量新生血管；但在植入8周后，轉(zhuǎn)染hVEGF165的細胞-膜復(fù)合物中可見較多新生的膠原、相對成熟的骨質(zhì)樣組織及較多的新生血管形成，這與王伯齡等的研究相符合[15]。因此，筆者認為，BMSCs被hVEGF165轉(zhuǎn)染后進行了一系列的正循環(huán)級聯(lián)反應(yīng)，這一反應(yīng)不僅有效地促進了血管形成，也進一步增加了新骨生成。hVEGF165轉(zhuǎn)染的BMSCs與膠原膜BME-10X復(fù)合后可以形成血管化的組織工程骨組織，通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)可克服重組生長因子局部直接使用所帶來半衰期短、引起免疫反應(yīng)和毒性等的一系列問題，為下一步牙周組織再生的體內(nèi)實驗提供了理論依據(jù)。

綜上所述，筆者認為，膠原膜BME-10X具有良好的生物相容性，轉(zhuǎn)染hVEGF165后的SD大鼠BMSCs能在其中生長。體外合成的復(fù)合物在裸鼠體內(nèi)具有異位成骨能力和良好的血管生成能力。但轉(zhuǎn)染hVEGF165的BMSCs與膠原膜細胞及支架材料的相互作用機制及影響因素，以及上述復(fù)合物植入人體后能否最終促進牙周組織的再生，尚有待進一步的研究證實。

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(編輯:張慧茹)

The Complex Constructed by hVEGF165Genes Transfected BMSCs and Collagen Membrane (BME-10X) Enhanced Osteogenesis and Angiogenesis

JIANG Yan1， ZHU Xiaofeng1， YAN Fuhua2

1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China;2.Institute and Hospital of Stomatology, Nanjing University School of Medicine, Nanjing 210008, China

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the possibility of forming new bones in rats by incorporating the hVEGF165transfected BMSCs with collagen membrane (BME-10X) to form a tissue-engineered cell and matrix complex, and transplanting it into Sprague Dawley rats.MethodsThe hVEGF165transfected BMSCs were cultured in BME-10X collagen matrix for 3 days.Histological examination was performed with light microscopy and H-E staining.Cell attachment was analyzed by fluorescence microscope, confocal laser scanning microscope, and scanning electron microscope.The gene-modified tissue-engineered complex, which was constructed by transfected BMSCs and BME-10X, was implanted into subcutaneous sites in nude mice.After 4 and 8 weeks, the animals were sacrificed and the tissue-engineered complex was evaluated by histology.ResultsWhen the transfected cells were seeded in BME-10X, it was noted that cell adhered and stretched well after 24 h of culture.Investigation under tomographic scanning with confocal laser scanning confocal microscope showed that cell and material integrated well.The study in vivo showed that when BMSCs were transplanted in the subcutaneous sites of nude mice, the transfected BMSC complex formed more contents of ossification and angiogenesis than those in the un-transfected group.ConclusionIn this study the BME-10X showed a good biocompatibility with hVEGF165transfected BMSCs.BMSCs transfected with VEGF165gene showed enhanced osteogenesis and angiogenesis both in vitro and in vivo.

KEY WORDS:vascular endothelial growth factor (hVEGF)； bone marrow stromal cells; gene therapy； tissue engineering； periodontal regeneration； collagen membrane

收稿日期:2015-09-15

基金項目:福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2013-ZQN-JC-22)；福建醫(yī)科大學橫向科研課題(2013B003)

作者簡介:江燕(1986-)，女，醫(yī)師，醫(yī)學碩士通訊作者: 朱小峰. Email: dentzxf@163.com

中圖分類號:R322.41； R329-33； R394.2； R783.1

文獻標志碼:A

文章編號:1672-4194(2016)01-0011-04

2.南京大學 口腔醫(yī)學院，南京210008