李　中，向科翰，鄒遠(yuǎn)超，岳興建，王永明，覃川杰，謝碧文，王　淯，齊澤民

(內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，長江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點實驗室，四川內(nèi)江　641112)

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白烏鱧染色體核型和DNA含量分析

李中，向科翰，鄒遠(yuǎn)超，岳興建，王永明，覃川杰，謝碧文，王淯，齊澤民

(內(nèi)江師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，長江上游魚類資源保護(hù)與利用四川省重點實驗室，四川內(nèi)江641112)

摘要：通過向活體白烏鱧(Opniocepnalus argus)腹腔注射植物血凝素(PHA)和秋水仙素進(jìn)行短期藥物處理后，制備染色體標(biāo)本并對其核型進(jìn)行分析。以雞血細(xì)胞DNA 含量為標(biāo)準(zhǔn)(2.50 pg)，用流式細(xì)胞儀測定了白烏鱧外周血細(xì)胞的DNA 含量。結(jié)果表明:(1)白烏鱧的染色體組為2 n=48，核型公式為4 m+22 st+22 t，總臂數(shù)NF=52，無性染色體。(2)白烏鱧的DNA含量為雞血對照的0.59倍，其DNA含量為(1.48±0.04)pg/N。白烏鱧的染色體數(shù)和DNA 含量均顯示其具有二倍體特征。依據(jù)實驗結(jié)果推論白烏鱧為烏鱧的白化變異個體。

關(guān)鍵詞：白烏鱧(Opniocepnalus argus)；染色體；核型；DNA含量

白烏鱧(Opniocepnalusargus)又叫白甲烏鱧，俗稱白烏棒，隸屬鱸形目、鱧科(Channidae)鱧屬，是一種兇猛的肉食性名貴魚類。主要分布在四川省嘉陵江中下游流域[1-2]。體型與烏鱧(Channaargus)相似，體色相對淺而呈灰白色，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長速度快、出水后不易死亡等特點，且肉嫩，味鮮，刺少，有補(bǔ)血、利尿的功能。因其具有較高的營養(yǎng)價值，是老人、孕婦以及小孩兒良好的滋補(bǔ)品[3]。

目前，關(guān)于白烏鱧的研究主要集中在生物學(xué)特性[2]、形態(tài)特征[3]及養(yǎng)殖技術(shù)[4-5]等方面。前期的研究表明，白烏鱧和烏鱧具有很高的形態(tài)和遺傳相似性[3]，而針對白烏鱧的種質(zhì)特征及遺傳變異等方面的研究尚未見報道。利用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)能快速準(zhǔn)確地鑒定物種倍性。目前，已廣泛運(yùn)用于魚類、蝦類等DNA含量和倍性檢測[6-9]。通過流式細(xì)胞術(shù)，同一種魚類的DNA含量是恒定的，具有種的特異性，可作為一個物種種質(zhì)的特征性參數(shù)[6]。同時，研究魚類染色體核型對了解魚類的遺傳組成及遺傳變異等具有重要意義[10]。本試驗通過對白烏鱧的染色體數(shù)量、核型和DNA含量進(jìn)行研究，以期探討白烏鱧在細(xì)胞水平上的種質(zhì)特性，為白烏鱧的種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)分類地位和細(xì)胞遺傳學(xué)背景提供基礎(chǔ)資料。

1材料和方法

1.1實驗材料

實驗所用魚來自于四川省內(nèi)江市江龍水產(chǎn)公司白烏鱧人工養(yǎng)殖基地，健康狀況良好，雌雄各6尾，體重70～100 g之間，實驗魚運(yùn)回實驗室后在24 ℃水族箱中飼養(yǎng)至少24 h后開始實驗。

1.2實驗方法

參照李思發(fā)[10]活體注射法，以0.01 mL/g的劑量標(biāo)準(zhǔn)向魚體腹腔注射配制好的植物血球凝集素(PHA，采用鹽水法提取綠豆PHA[11])，在24 ℃±1 ℃的水環(huán)境中飼養(yǎng)12 h后，注射同等計量的PHA溶液。12 h后，按照3 μg/g的劑量標(biāo)準(zhǔn)向魚體腹腔內(nèi)注射0.003%的秋水仙素。處理4 h，斷腮斷尾放血10 min，解剖魚體取腎，置于生理鹽水(0.85%)中，去除組織膜和血塊后放入加有生理鹽水的1.5 ml離心管，用眼科手術(shù)剪盡可能將其剪碎。靜置直至出現(xiàn)沉淀，取上清液用濾網(wǎng)過濾收集濾液，用移液槍吸打細(xì)胞2 min。以1300 r/min離心15 min，收集細(xì)胞，加入0.0375 mol/L的KCl低滲液，用移液槍吸打1 min左右。置于37 ℃的恒溫?fù)u床上低滲1 h?；匦p搖30 min后，取出吸打1 min左右，再次放入搖床。最后，1300 r/min下離心15 min。棄上清液，加入卡諾氏固定液(V甲醇∶V冰乙酸體積比3∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用)，輕而緩的吸打30 s。在常溫下靜置固定45 min后，于1000 r/min下離心20 min，去除上清液，重復(fù)固定一次。固定結(jié)束后，在1000 r/min下離心20 min去掉上清液，加入適量重新配的固定液，從50 cm左右的高度向傾斜的冰凍玻片上滴片，將玻片滴滿但不重疊。自然干燥后，用Giemsa染液染色。30 min后，用細(xì)水流從載玻片背面沖洗脫色。待其干燥后顯微油鏡下觀察。

選取數(shù)張分散度良好、獨立且數(shù)目完整的細(xì)胞圖片進(jìn)行染色體計數(shù)，統(tǒng)計各個細(xì)胞中染色體數(shù)目，確定其具體總數(shù)。使用軟件Adobe Photoshop7.0對形態(tài)清楚處于細(xì)胞分裂中期的染色體分裂相圖片，依據(jù)Levan[12]提出的關(guān)于染色體核型分析的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行摳圖、測量、配對，并計算染色體的各項指標(biāo)，完成白烏鱧核型圖。

用加有抗凝劑的注射器在白烏鱧尾柄靜脈處采血，用PBS (PH=7.4)調(diào)成血細(xì)胞數(shù)為106/mL 的細(xì)胞懸液。用Beckman coulter試劑NIM-DAPI染色1 min。用美國Beckman Coulter生產(chǎn)的 CytoFlex 流式細(xì)胞儀進(jìn)行樣品分析。以雞的紅細(xì)胞DNA含量(2.50 pg)作為對照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測。白烏鱧的DNA含量依照以下公式計算：

P=2.50×E2/E1

式中：E1表示雞紅細(xì)胞熒光值；E2表示白烏鱧紅細(xì)胞熒光值；P表示白烏鱧的DNA含量(pg)。

2結(jié)果

2.1染色體數(shù)目統(tǒng)計

通過對100個分裂相較好的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計，從表1中可以看到染色體數(shù)目低于或等于30條的有18個細(xì)胞，占總細(xì)胞數(shù)的18%；染色體數(shù)高于39條并且少于48條的有22個細(xì)胞，占總數(shù)的22%；而染色體數(shù)目為48的共有52個細(xì)胞，占總數(shù)的52%，而高于48條的細(xì)胞共有8個，所占比例為8%。由此可知確定，白烏鱧的染色體眾數(shù)為48，即2 n=48。

2.2核型分析

選取12個處于分裂中期分裂相良好，形態(tài)清晰的染色體組進(jìn)行核型分析，通過測量、計算染色體的相對長度以及臂比，統(tǒng)計結(jié)果見表2。染色體中期分裂相如圖1所示。按照Levan[8]的標(biāo)準(zhǔn)將白烏鱧的染色體分為三組，如圖2所示，即中部著絲點染色體(m)有2對，亞端部著絲點染色體(st)11對，端部著絲粒染色體(t)的染色體總共有11對。由此統(tǒng)計得出白烏鱧的核型公式為4 m+22 st+22 t，染色體臂數(shù)：NF=52。在所觀察的白烏鱧中期分裂相中未發(fā)現(xiàn)異型染色體。

表1　白烏鱧中期分裂相染色體計數(shù)統(tǒng)計

表2　白烏鱧魚染色體的相對長度和臂比(X±S)

注：中部著絲點染色體(m)；亞端部著絲點染色體(st)；端部著絲粒染色體(t)。相對長度=每條染色體長度/單倍染色體長度×100%(精確到0.01)；臂比=長臂(q)/短臂(p)(精確到0.01)；表中1～24編號與圖2相對應(yīng)。

圖1　白烏鱧染色體中期分裂相

圖2　白烏鱧染色體核型

2.3白烏鱧DNA含量

實驗中，選取20尾白烏鱧通過流式細(xì)胞儀(flow cytometer，F(xiàn)CM)進(jìn)行細(xì)胞DNA含量的測定,結(jié)果見表3。雞血細(xì)胞熒光強(qiáng)度為200.30±3.40(n=5)，白烏鱧血細(xì)胞熒光強(qiáng)度為118.58±1.30(n=20)，白烏鱧的DNA含量為雞血對照的0.59倍。根據(jù)公式P=2.5×E2/E1計算得到白烏鱧血細(xì)胞DNA含量為(1.48±0.04)pg/N(圖3)。

表3　白烏鱧紅細(xì)胞DNA含量(X±S)

圖3　雞血細(xì)胞(a)和白烏鱧血細(xì)胞(b)DNA相對含量直方圖

3討論

魚類染色體對于研究魚類的遺傳、變異、分類、系統(tǒng)演化及種族關(guān)系的鑒定等都具有重要意義[13]。對其染色體進(jìn)行核型分析，可以幫助人們對該種生物的遺傳組成、遺傳變異規(guī)律和發(fā)育機(jī)制有所了解，而且對種間雜交和多倍體育種結(jié)果的預(yù)測和鑒定、性別遺傳機(jī)理以及基因組數(shù)的了解、種群的進(jìn)化和種族間關(guān)系的鑒定等都具有重要的參考價值[14-19]。

從實驗結(jié)果看，白烏鱧的染色體組數(shù)為2 n=48，核型公式為：4 m+22 st+22 t，NF=52。目前國內(nèi)已有的研究認(rèn)為大多數(shù)的魚類還沒有性染色體，性染色體機(jī)制仍處在進(jìn)化的初級階段[12-15]，本次實驗也沒有觀察到性染色體。目前已知的鱧科魚類大概有20余種，而我國只有三種，分別是：烏鱧、斑鱧和月鱧。其染色體組型統(tǒng)計如表4。

表4　4種鱧科魚類的染色體組型

從表4可知，白烏鱧的染色體不同于月鱧和斑鱧，臂數(shù)高于斑鱧和月鱧，而其染色體的組型特征及臂數(shù)與烏鱧的相同。王金星等[3]的研究結(jié)果顯示二者除體色外各方面沒有明顯的區(qū)別，從而證明了白烏鱧不屬于單獨的亞種而是普通烏鱧的變異。本研究從染色體組型上再次證明了這個結(jié)論。小島吉雄[25]曾提出，染色體的收斂程度越高，也就是說st和t組型越多，即染色體的臂數(shù)越少，那么該物種的進(jìn)化程度也就越高，依據(jù)此研究結(jié)果可以看到白烏鱧的進(jìn)化程度與烏鱧相同，高于月鱧和斑鱧。烏鱧與白烏鱧在體色上有顯著的差異。烏鱧又被稱為黑魚，灰黑色，只有腹部淡白，而白烏鱧體色灰白，從體色上可明確區(qū)分。全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖戶所熟知的白化，也就是動物體內(nèi)黑色素缺乏或黑色素的生成發(fā)生障礙所導(dǎo)致的一種體色異常病[26]。因而推測白烏鱧可能是烏鱧白化的結(jié)果。

從黃冰等[27]總結(jié)的Lnagaki等多年對青鳉魚白化突變個體的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)白化大多數(shù)是由于一個核苷酸的突變使得決定氨基酸的第三個密碼子突變而導(dǎo)致的，但其他的基因序列正常。同時，在此次實驗的結(jié)果中可以看到二者在核型上沒有明顯區(qū)別，因此可以判斷白烏鱧是烏鱧白化的變異體。究竟是什么位置上的基因發(fā)生突變導(dǎo)致白烏鱧體色白化，還需要對其DNA序列和染色體進(jìn)化的機(jī)理、原因進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞核DNA 含量反應(yīng)了物種基因組的大小，而流式細(xì)胞儀的應(yīng)用，大大提高了檢測速度和精確性[28-30]。不同物種基因組大小基本存在差別，所以DNA 含量的準(zhǔn)確測定可以用于種質(zhì)鑒定。如段愛麗等[30]發(fā)現(xiàn)，斑鱧、烏鱧、斑烏鱧及烏斑鱧這4 種魚血細(xì)胞DNA 的絕對含量分別為(1.488±0.035) pg/N、(1.489±0.034) pg/N、(1.522±0.077) pg/N和(1.520±0.033) pg/N。且雜交種的細(xì)胞核DNA 含量顯著高于父母本。本研究結(jié)果顯示白烏鱧血細(xì)胞的DNA含量為(1.48±0.04)pg/N，與段愛麗等[27]的對烏鱧研究結(jié)果相似，顯示出二倍體特征。這點也與染色體核型分析結(jié)果一致。

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(責(zé)任編輯：張紅林)

Analysis on karyotype and DNA content of Opniocepnalus argus

LI Zhong，XIANG Ke-han，ZOU Yuan-chao，YUE Xing-jian，WANG Yong-ming，QIN Chuan-Jie，XIE Bi-wen，WANG Yu，QI Ze-min

(CollegeofLifeSciences,NeijiangNormalUniversity;ConservationandUtilizationofFishesResourcesintheUpperReachesoftheYangtzeRiverkeyLaboratoryofSichuanRrovince,

Neijiang641112,Sichuan,China)

Abstract：The chromosome specimen was made by injecting phytohemagglutinin and colchicine in the living Opniocepnalus argus’s abdominal and using the short-term drug treatment to analyze its karyotype.While erythrocyte nuclear DNA content of O.argus var was determined by using a flow cytometer (Beckman Coulter Inc.,USA) with serving the chicken erythrocytes (their DNA content is 2.50 pg) as reference cells to provide the scientific basis for the variety identification and taxonomic position of system .The result showed that the chromosome number of O.argus var was 2 n=48.The karyotype formula was 4 m+22st+22t,and arms number (NF)=52.The heterochromosomes were not observed.The diploid cellular DNA contents of O.argus var was (1.48±0.04) pg·N-1,which was 0.59 times to the chicken erythrocytes.And the contents of DNA and chromosomes number of O.argus var had the diploid characteristic.It can be indicated that the O.argus var was the albino mutation individual of Channa argus.

Key words：Opniocepnalus argus;chromosome;karyotype;DNA content

收稿日期：2015-06-18 ；

修訂日期：2015-09-11

第一作者簡介：李中，內(nèi)江師范學(xué)院在讀本科生。E-mail:954713495@qq.com通訊作者：鄒遠(yuǎn)超。E-mail:zou3891@163.com

中圖分類號：S917.43

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)03-0104-05

資助項目：四川省教育廳科技創(chuàng)新科研團(tuán)隊基金項目(No.KYTD201009);四川省科技廳項目(No.2015JY0262)；四川省大學(xué)生科研項目(201410640002)

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