趙　艷,宋　軍,楊發(fā)樹,張艷紅,張鳳枰,劉耀敏,范秀麗

(通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營(yíng)養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都　610041)

?

微波輔助蛋白質(zhì)水解-反相高效液相色譜法測(cè)定羅非魚皮中的羥脯氨酸

趙艷,宋軍,楊發(fā)樹,張艷紅,張鳳枰,劉耀敏,范秀麗

(通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營(yíng)養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都610041)

摘要：為測(cè)定羅非魚(Oreochromis niloticus)皮中羥脯氨酸含量，建立了微波輔助蛋白質(zhì)水解-反相高效液相色譜法。實(shí)驗(yàn)采用9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC-Cl)為衍生試劑，應(yīng)用ZORBAX SB-C18色譜柱，以0.05 mol/L的醋酸鈉溶液和甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，DAD檢測(cè)器在262 nm處進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，羥脯氨酸線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，回收率92.00%～103.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.53%～3.61%，檢出限為0.2 mg/g。

關(guān)鍵詞：微波輔助蛋白質(zhì)水解；反相高效液相色譜法；羅非魚皮；羥脯氨酸

羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是膠原蛋白的主要組成成分，不屬于20種常見的氨基酸。目前，常見的三種膠原蛋白是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型膠原蛋白是動(dòng)物皮的主要成分之一，它含有大量的脯氨酸和羥脯氨酸(HYP)。羥脯氨酸約占膠原蛋白中氨基酸總量的10%，而在其它蛋白質(zhì)中含量甚微，這使得它幾乎成為膠原蛋白所特有的成分，因而可通過測(cè)定羥脯氨酸含量來計(jì)算膠原蛋白的含量，從而確定膠原蛋白的總體水平[1]。

目前，測(cè)定羥脯氨酸的方法有多種，包括分光光度法[2-3]、毛細(xì)管電泳法[4-5]、離子色譜法[6]、高效液相色譜法[7-9]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]等，其中以高效液相色譜法最為常用。羥脯氨酸通常以蛋白質(zhì)的形式存在于樣品中，首先需要進(jìn)行水解，解離為游離態(tài)羥脯氨酸后才能測(cè)定。目前通常用常規(guī)酸水解法[13]。然而常規(guī)酸水解方法耗時(shí)，步驟繁瑣，且水解過程不易控制。而采用微波輔助蛋白質(zhì)水解樣品，避免以上麻煩，并且易于控制酸水解條件，重現(xiàn)性好。目前利用微波輔助蛋白質(zhì)水解前處理方法，采用高效液相色譜儀測(cè)定羥脯氨酸的系統(tǒng)研究，在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助蛋白水解結(jié)合反相高效液相色譜法對(duì)羅非魚皮中的羥脯氨酸的測(cè)定進(jìn)行了研究。

1材料與方法

1.1儀器、試劑和材料

實(shí)驗(yàn)用羅非魚魚皮從市場(chǎng)購(gòu)買。

Agilent 1260 高效液相色譜儀，G4212B DAD檢測(cè)器 美國(guó)Agilent公司；ETHOS 1微波水解儀 意大利Milestone公司；Allegra 64 R離心機(jī) BECKMAN COULTER公司；KQ5200B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP225D 電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司。

L-羥脯氨酸(L-HYP，純度99%)標(biāo)準(zhǔn)品、 9-芴基甲氧基羰酰氯(FMOC-Cl) Sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；乙酸鈉、硼酸(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；其它試劑均為優(yōu)級(jí)純；水為Milli-Q Gradient超純水。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液和衍生溶液的配制

準(zhǔn)確稱取50 mg羥脯氨酸(99%)，用0.1 mol/L的HCI溶液定容至100 mL容量瓶，配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，可根據(jù)需要稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

0.05 mol/L FMOC衍生試劑配制：稱取0.13 g FMOC，用丙酮溶解，并定容至10 mL。

0.2 mol/L硼酸緩沖液(pH 9.0)：用NaOH調(diào)節(jié)pH值。

1.3HPLC分析條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱，150 mm×4.6 mm,5 μm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：DAD檢測(cè)器，波長(zhǎng)為262 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.05 mol/L的醋酸鈉溶液；梯度洗脫條件見表1。

表1　梯度洗脫條件

1.4供試樣品溶液的制備

1.4.1樣品水解

1.4.1.1常規(guī)酸水解法

參照文獻(xiàn)[13]水解方法進(jìn)行樣品前處理。所有樣品重復(fù)3次測(cè)定，結(jié)果取平均值。

1.4.1.2微波輔助蛋白質(zhì)水解法

將樣品解凍、絞碎，準(zhǔn)確稱取樣品50 mg(精確至0.01 mg)于微波水解石英杯中，加入6 mol/L HCL溶液0.5 mL，依次放置于水解槽中，水解主控罐內(nèi)加入6 mol/L HCI溶液120～150 mL，蓋好水解罐。將水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮?dú)庖员Ｗo(hù)樣品，重復(fù)3 次。在1 000 W 功率條件，常溫至160 ℃升溫20 min，160 ℃溫度保持20 min，當(dāng)溫度冷卻至室溫后打開密封裝置，取出水解槽，將微波水解瓶逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，超純水定容至50 mL。

1.4.2衍生

取過濾后的稀釋液100 μL于5 mL 具塞離心管中，依次加入硼酸緩沖液900 μL，F(xiàn)MOC衍生試劑300 μL，漩渦混勻，衍生10 min，0.22 μm濾膜過濾，待高效液相色譜儀測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理?xiàng)l件的選擇

2.1.1微波輔助蛋白質(zhì)水解條件的優(yōu)化

固定微波時(shí)間20 min，考察不同微波水解溫度(140 、150、160 、170 ℃)的影響(圖1)，以及固定微波溫度，考察不同微波水解溫度保持時(shí)間(10、20、30 min)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響(圖2)，最終選擇160 ℃溫度保持20 min為最佳條件。

2.1.2微波水解法與常規(guī)水解法的比較

采用微波法水解測(cè)定樣品中羥脯氨酸含量的同時(shí)，運(yùn)用傳統(tǒng)的常規(guī)酸水解法110 ℃水解22 h進(jìn)行測(cè)定，并將測(cè)得的結(jié)果用T檢驗(yàn)法進(jìn)行了比較，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，兩種水解方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差均小于3.0%，經(jīng)T檢驗(yàn)，微波水解法與常規(guī)水解法測(cè)定結(jié)果不存在顯著差異(P>0.05)，在所選擇的條件下微波輔助蛋白質(zhì)水解測(cè)定結(jié)果與常規(guī)法一致。

圖1　不同微波水解溫度的HYP含量變化曲線

圖2　不同微波水解時(shí)間的HYP含量變化曲線

2.1.3衍生試劑的選擇

氨基酸分析中常用的柱前衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)、丹磺酰氯(DANSYL-C1)、異硫氰酸苯酯(PITC) 和9-芴基甲氧基羰酰氯 (FMOC-Cl)等。OPA只能與一級(jí)胺反應(yīng)，DANSYL-C1與PITC雖能與羥脯氨酸直接反應(yīng)，但前者反應(yīng)活性較差，速度慢，后者需專門的衍生裝置在無水條件下進(jìn)行。魚皮的水解產(chǎn)物中存在很多種氨基酸，大部分為一級(jí)胺，因此國(guó)內(nèi)外有不少文獻(xiàn)采用雙衍生劑的方法，即先用OPA封閉所有的一級(jí)胺，除去OPA與一級(jí)胺衍生物后，再用FMOC-Cl與羥脯氨酸反應(yīng)，方法復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。本試驗(yàn)采用FMOC-Cl直接衍生羅非魚魚皮水解液，通過優(yōu)化液相色譜分離條件即可分離出羥脯氨酸，并排除了其它干擾峰。

表2　兩種水解方法羥脯氨酸含量的比較(n=3)

2.2高效液相色譜分析條件的選擇

采用Agilent 1260 高效液相色譜儀，比較ZOBAX XDB C18柱和ZOBAX SB-C18柱對(duì)羥脯氨酸的分離效果，發(fā)現(xiàn)ZOBAX XDB C18柱出峰時(shí)間靠前，且峰形較差，而使用ZOBAX SB-C18柱取得了良好的分離效果，標(biāo)準(zhǔn)品分離效果見圖3和圖4。

圖3　ZOBAX XDB C18色譜柱分離圖

2.3線性關(guān)系及檢出限的考察

將羥脯氨酸配制成1，2，5，10，25，50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照上述色譜條件進(jìn)樣，以HYP濃度為橫坐標(biāo)(x) ，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y) ，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5?；貧w方程：y=106.312 9x+2.919 8，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，表明在1～50 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍信噪比計(jì)算檢出限，本方法檢出限為0.2 mg/g。

圖4　ZORBAX SB-C18色譜柱的分離圖

圖5　HYP峰面積與標(biāo)液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4方法的精密度和回收率試驗(yàn)

為考察方法的精密度和可靠性，在樣品中分別添加3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每水平3個(gè)平行樣，按照1.4樣品溶液制備方法進(jìn)行處理，用1.3儀器條件進(jìn)行測(cè)定，回收率結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，羥脯氨酸的回收率92.0%～103.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.53%～3.61%，符合試驗(yàn)要求。

表3　羥脯氨酸的回收率和測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

2.5羅非魚皮中羥脯氨酸的測(cè)定

按照1.4樣品溶液制備方法進(jìn)行處理，對(duì)羅非魚皮中的羥脯氨酸進(jìn)行了提取，按照1.3儀器條件進(jìn)行測(cè)定，得到羥脯氨酸的HPLC 圖譜，見圖6。

圖6　羅非魚魚皮中羥脯氨酸的色譜圖

3討論

3.1微波輔助蛋白質(zhì)水解的優(yōu)勢(shì)

對(duì)比微波水解法和常規(guī)水解方法，兩種水解方法測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差均小于3.0%，經(jīng)T檢驗(yàn)，微波水解法與常規(guī)水解法測(cè)定結(jié)果不存在顯著差異(P>0.05)。而且微波水解時(shí)間約為常規(guī)水解方法的1/10，大大縮短了分析時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

3.2衍生試劑及液相色譜條件的選擇

羅非魚皮中存在很多氨基酸及其代謝物，大部分為一級(jí)胺，可以和OPA迅速發(fā)生反應(yīng)，而HYP具有二級(jí)胺結(jié)構(gòu)，不能直接與OPA反應(yīng)，但可與異硫氰酸苯酯(PITC)或FMOC反應(yīng)并形成穩(wěn)定的衍生物。有些研究用OPA與一級(jí)胺衍生物，再用FMOC衍生羥脯氨酸進(jìn)行分離。此法雖選擇性好但樣品處理費(fèi)時(shí)，不適合處理大批量樣品。本試驗(yàn)采用FMOC-Cl直接衍生羅非魚魚皮水解液，并選用適合分離極性化合物的ZOBAX SB-C18色譜柱，通過優(yōu)化液相色譜分離條件即可分離出羥脯氨酸，并排除了其它干擾峰。

利用微波輔助蛋白質(zhì)水解-反相高效液相色譜法測(cè)定羅非魚皮中的羥脯氨酸，方法簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好、分離效果良好、靈敏度高、檢測(cè)結(jié)果可信度高，可以滿足魚皮中羥脯氨酸的檢測(cè)需要。

參考文獻(xiàn)：

[1]鄒曉莉，黎源倩，曾紅燕，等．反相高效液相色譜 法測(cè)定人肌腱中的膠原蛋白[J].色譜，2006，24 (3)：263-266.

[2]張俊杰,曾慶孝.比色法測(cè)定魚鱗中羥脯氨酸的研究[J].食品科技,2004,(4):83-85.

[3]郭恒斌,曾慶祝.分光光度法測(cè)定魚皮中羥脯氨酸含量[J].食品研究與開發(fā),2007,28 (10):145-148.

[4]薛靜,梁恒,李甜,等.毛細(xì)管電泳-電致化學(xué)發(fā)光法測(cè)定人尿中脯氨酸和羥脯氨酸[J].分析化學(xué),2005,33(6):785-788.

[5]Dong Y L,Yan N,Li X,et al.Rapid and sensitive determination of hydroxyproline in dairy products using micellar electrokinetic chromatography with laser-induced fluorescence detection[J].J Chromatogr A,2012,1233(7):156-160.

[6]張怡評(píng),易瑞灶,陳暉,等.離子色譜法測(cè)定魚鱗膠原蛋白中羥脯氨酸含量方法的研究[J].中國(guó)海洋藥物,2011,30(4):45-48.

[7]崔勇,劉智,張博,等.反相高效液相色譜柱前衍生法測(cè)定保健食品中羥脯氨酸的含量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2008,18(11):2247-2248,2259.

[8]Ikehara T,Habu N,Nishino I,et a1.Determination of hydroxyproline in rat urine by high-performance liquid chromatography with electrogenerated chemiluminescence detection using tris(2，2′-bipyridyl) ruthenium(Ⅱ)[J].Anal Chim Acta,2005,536:129-133.

[9]Hutson P R,Crawford M E,Sorkness R L.Liquid chromatographic determination of hydroxyproline in tissue[J].J Chromatogr B,2003,791:427-430.

[10]Colgravea M L,Allingham P G,Jonesc A.Hydroxyproline quantification for the estimation of collagen in tissue using multiple reaction monitoring mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2008,1212(1-2):150-153.

[11]Kindt E,Gueneva-Boucheva K,Rekhter M D,et a1.Determination of hydroxyproline in plasma and tissue using electrospray mass spectrometry[J].J Pharmaceut Biomed,2003,33(5):1081-1092.

[12]夏金根,陳波,姚守拙.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定膠原蛋白中的羥脯氨酸[J].色譜,2008,26(5):595-598.

[13]DB37/T 2094-2012,水產(chǎn)品中羥脯氨酸含量的測(cè)定 高效液相色譜法[S].

(責(zé)任編輯：鄧薇)

Determination of hydroxyproline in the skin of Oreochromis niloticus by reversed-phase high performance liquid chromatography after microwave-assisted acid hydrolysis of protein

ZHAO Yan,SONG Jun,YANG Fa-shu,ZHANG Yan-hong,ZHANG Feng-ping,LIU Yao-min,FAN Xiu-li

(KeyLaboratoryofAquatic,Livestock,PoultryNutritionandHealthyCulturing,MinistryofAgriculture,TongweiCo.,Ltd.,Chengdu610041,China)

Abstract：A method was established for the determination of hydroxyproline in the skin of tilapia(Oreochromis niloticus)by reversed-phase high performance liquid chromatography after microwave-assisted acid hydrolysis of protein.After derivatization by 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC-Cl),separation and quantification was achieved on a ZORBAX SB-C18column by gradient elution with methanol and 0.05 mol/L sodium acetate buffer.The detection was carried out with diode array detector (DAD)by absorbance at 262 nm.The external standard calibration curves were used for quantification.There were good linear correlations for hydroxyproline (r=0.999 9).Average spike recovery of hydroxyproline was 92.00%～103.25%,with relative standard devitations 2.53%～3.61%,and the limit of detection for hydroxyproline was 0.2 mg/g.This method is simple,sensitive,reproducible and suitable for the determination of hydroxyproline in fish skin.

Key words：microwave-assisted acid hydrolysis of protein;reversed-phase high performance liquid chromatography;skin of Oreochromis niloticus;hydroxyproline

收稿日期：2015-06-02；

修訂日期：2015-12-09

第一作者簡(jiǎn)介：趙艷(1983-)，女，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)和食品及飼料產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)。E-mail：zhao518yan@126.com

中圖分類號(hào)：TS254.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)03-0099-05

資助項(xiàng)目：四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011NZ0071)