車爽+程然+蔣薇+張健+薄士儒

摘要：目的：研究鹿茸膠原蛋白對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響，比較不同濃度膠原蛋白對(duì)創(chuàng)傷愈合的影響程度。方法：采用低溫酶解法提取鹿茸膠原蛋白，在正常小鼠皮部造成急性創(chuàng)傷模型，設(shè)1個(gè)對(duì)照組，1個(gè)京萬(wàn)紅陽(yáng)性對(duì)照組，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別涂不同濃度膠原蛋白。觀察創(chuàng)面愈合情況，用創(chuàng)傷愈合率體現(xiàn)。并測(cè)其皮膚強(qiáng)脯氨酸含量，進(jìn)而對(duì)比膠原含量。結(jié)果：高濃度膠原蛋白涂抹的傷口愈合率較高，其皮部膠原較多。結(jié)論：鹿茸膠原蛋白對(duì)創(chuàng)傷愈合有促進(jìn)作用，且愈合程度與膠原蛋白的濃度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：生藥學(xué)； 膠原蛋白；創(chuàng)傷愈合；羥脯氨酸

中圖分類號(hào)： S865.42 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2017.13.017

鹿茸具有廣泛的藥理作用，但是深加工研究滯后，對(duì)其提取物有效活性成分的研究甚少。膠原蛋白由于結(jié)構(gòu)獨(dú)特，理化性質(zhì)及生物特性非常突出，在醫(yī)療上的應(yīng)用具體表現(xiàn)在膠原蛋白具有低免疫源性、組織之間的協(xié)調(diào)作用強(qiáng)、物理機(jī)械性能好，可生物降解度高，具體體現(xiàn)在止血、治療燒傷和骨折等方面手術(shù)的應(yīng)用。

目前，以鹿茸為主料，分離提取出對(duì)醫(yī)學(xué)，對(duì)機(jī)體具有調(diào)節(jié)作用的膠原蛋白活性物質(zhì)成分，研究其對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合作用的研究未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本研究為后續(xù)開(kāi)發(fā)鹿茸膠原蛋白相應(yīng)的藥品（如噴劑）奠定理論基礎(chǔ)，以達(dá)到科學(xué)利用現(xiàn)有的鹿茸資源，增加鹿茸產(chǎn)品附加值的目的，從而促進(jìn)我國(guó)鹿業(yè)養(yǎng)殖實(shí)現(xiàn)可持續(xù)性發(fā)展。

1 材料與方法

1.1主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、高速離心機(jī)、真空冷凍干燥機(jī)。

1. 2實(shí)驗(yàn)材料

新鮮鹿茸，清潔級(jí)胰蛋白酶，清潔級(jí)小白鼠50只，羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品等。

1.3方法

1.3.1提取 在4℃條件下，利用鹽酸使梅花鹿茸灰分中的不溶物變成可溶性鹽類，選擇氯化鈉溶液作為除雜蛋白的主要試劑，達(dá)到將其脫除的目的[1]。采用徐云鳳的胰蛋白酶水解制備鹿茸膠原蛋白的方法，取新鮮的鹿茸50克，加入150毫升乳酸鹽的緩沖液，用組織絞碎機(jī)絞碎，加入胰蛋白酶0.5克，加入激活劑氯化錳0.05克，pH值調(diào)為8.0，將溶液的溫度調(diào)至52℃，放入反應(yīng)罐3小時(shí)，離心去殘?jiān)?，收集透明澄清的液體，在10℃條件下進(jìn)行酶解提取[2]。

1.3.2純化 在中性條件下鹽析全部膠原蛋白，方法如下：向梅花鹿茸膠原蛋白酶解液中緩慢加入，并攪拌經(jīng)過(guò)研磨的氯化鈉，充分?jǐn)嚢瑁o止10～24小時(shí)，以便膠原蛋白充分析出，再以8000轉(zhuǎn)的速度離心，收集沉淀物后用0.5mol/L乙酸進(jìn)行溶解，并對(duì)0.5mol/L乙酸進(jìn)行透析，以便除去沉淀中的多余鹽分，最后將樣品進(jìn)行真空凍干[3]。

1.3.3動(dòng)物造模分組及給藥 購(gòu)買(mǎi)清潔級(jí)小白鼠50只，分別用乙醚進(jìn)行淺麻醉。局部備皮，常規(guī)消毒，將小鼠皮部取直徑為1厘米的圓形切口，切開(kāi)皮膚全層， 至深筋膜， 制作出直徑相同的圓形創(chuàng)面， 然后以無(wú)菌紗布覆蓋， 造模完成。把小鼠隨機(jī)分成五組，根據(jù)人和小鼠的體重與表面積比計(jì)算得出小鼠給藥量=小鼠體表面積×小鼠體重/人的體表面積×人的體重×人體用量。設(shè)高、中、低3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)空白對(duì)照組，1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組，將實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面分別使用0.05mol/L，0.25mol/L，

0.5mol/L的梅花鹿茸膠原蛋白，每日兩次，空白組不進(jìn)行藥物治療，陽(yáng)性對(duì)照組用京萬(wàn)紅以相同藥量做陽(yáng)性對(duì)照。以無(wú)菌紗布覆蓋，防止感染，連續(xù)給藥觀察。

1.3.4羥脯氨酸含量檢測(cè) 膠原蛋白是構(gòu)成結(jié)締組織中膠原纖維的主要成分，含羥脯氨酸的量最多，是愈合組織中最重要的成分，在一定時(shí)間內(nèi)，創(chuàng)傷愈合部位組織中的膠原蛋白的含量會(huì)反映傷口的愈合程度[4]。羥脯氨酸是膠原蛋白中的特征性氨基酸，因此測(cè)定動(dòng)物組織中羥脯氨酸的含量即可定量觀察創(chuàng)傷組織的愈合程度。取創(chuàng)面皮膚經(jīng)脫水及脫脂處理后水解，根據(jù)羥脯氨酸的測(cè)定原理，使用氯化亞錫對(duì)梅花鹿茸膠原蛋白樣品進(jìn)行水解使其釋放羥脯氨酸，加入氯氨T、二甲氨基苯甲醛，于558納米波長(zhǎng)處比色，比較羥脯氨酸含量。若實(shí)驗(yàn)組羥脯氨酸含量高于空白對(duì)照組，則說(shuō)明創(chuàng)面膠原蛋白水平提高，即創(chuàng)面?zhèn)谟锨闆r較好[5]。

1.3.5創(chuàng)面愈合情況評(píng)價(jià) 描記創(chuàng)面愈合面積，以創(chuàng)面完全上皮化（病理證實(shí)）作為判斷依據(jù)，記錄創(chuàng)面愈合時(shí)間。每天觀察傷口愈合情況，并將創(chuàng)面描記在半透明的紙上，再以半透明紙作為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成圖樣大小，以硬紙片重量間接表示創(chuàng)面及愈合部分面積大小，將數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)起來(lái)，并以下式計(jì)算：創(chuàng)面愈合率（%）=（開(kāi)始創(chuàng)傷面積-未愈合創(chuàng)面面積）/開(kāi)始創(chuàng)傷面積[6]。再以實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的創(chuàng)面愈合率進(jìn)行對(duì)比，來(lái)確定鹿茸膠原蛋白是否起到愈合傷口的作用[7]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

5個(gè)分組創(chuàng)傷涂藥后均有不同程度的創(chuàng)面腫脹、滲出現(xiàn)象。傷口用藥組涂藥后創(chuàng)面出現(xiàn)腫脹、滲出程度較對(duì)照組輕。5個(gè)分組創(chuàng)傷2天后創(chuàng)面均有不同程度的干燥、結(jié)痂現(xiàn)象，其痂皮呈淡黃色，質(zhì)地較軟，無(wú)異常分泌物出現(xiàn)及感染情況出現(xiàn)。

2.2 小鼠創(chuàng)面愈合率（見(jiàn)表1）

2.3羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與吸光度的測(cè)定結(jié)果（見(jiàn)表2）

2.4以羥脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1）

計(jì)算其回歸方程為：y=0.076x+0.0035，r=0.9995（P<0.001），因此，吸光度和羥脯氨酸濃度之間有很好的相關(guān)性。

2.5小鼠組織中羥脯氨酸含量的測(cè)定（見(jiàn)表3）

由表3可知，小鼠創(chuàng)傷處組織中羥脯氨酸的含量逐漸遞增，由于羥脯氨酸濃度和膠原蛋白濃度成正相關(guān)，羥脯氨酸濃度的變化即可反映小鼠組織中膠原蛋白的變化，由此可知，鹿茸膠原蛋白對(duì)傷口愈合的對(duì)比情況。

3 討論與分析

經(jīng)實(shí)驗(yàn)初步證明，鹿茸膠原蛋白對(duì)傷口創(chuàng)傷愈合有促進(jìn)作用，不同濃度膠原蛋白對(duì)傷口的愈合率不同，高濃度的愈合率大于不用藥的傷口愈合率，且傷口的愈合程度與鹿茸膠原蛋白的濃度有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：車爽，在讀本科生，研究方向，制藥工程。

通訊作者：薄士儒，碩士，助教， 研究方向：生藥學(xué)和藥理學(xué)。