馬　強(qiáng)，劉青松，蔡　燕，何　城，梁　騎，劉　馨，王　靜，張國(guó)元，郭曉蘭*

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科；2.川北醫(yī)學(xué)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科；4.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液科，四川 南充637000)

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*通訊作者

1例疑似急變的CML患者的實(shí)驗(yàn)診斷

馬強(qiáng)1,2，劉青松1，蔡燕1,2，何城1，梁騎1，劉馨3，王靜4，張國(guó)元1,2，郭曉蘭1,2*

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科；2.川北醫(yī)學(xué)院 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科；4.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液科，四川 南充637000)

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一組起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，疾病過程包括慢性期、加速期和急變期。處于慢性期的病人經(jīng)過數(shù)月或數(shù)年之后可發(fā)生急變，此時(shí)惡性造血干細(xì)胞極度增生，可引起不明原因的發(fā)熱，脾進(jìn)一步增大，出現(xiàn)骨痛、出血以及髓外腫物等浸潤(rùn)現(xiàn)象，如皮膚組織腫塊，淋巴結(jié)腫大等。本例研究對(duì)象為男性，38歲，5年前診斷為“慢性粒細(xì)胞白血病”，給予干擾素、羥基脲等治療后白細(xì)胞逐漸降至正常，臨床癥狀好轉(zhuǎn)出院。近1月，患者自述服藥不規(guī)律，間斷服藥，并曾停藥近1周，后出現(xiàn)頭部脹痛，并逐漸累及眶周，伴眼花，眩暈感，10余天前檢查發(fā)現(xiàn)白血病再次升高(WBC 100+×109/L)，繼續(xù)口服甲磺酸伊馬替尼輔以布洛芬治療5天，白細(xì)胞為75.7×109/L，以“慢性粒細(xì)胞白血病”入院。體格檢查未發(fā)現(xiàn)脾進(jìn)行性增大，血常規(guī)未發(fā)現(xiàn)血小板進(jìn)行性增高或降低，但患者左上肢及雙下肢存在多個(gè)棕色疣狀突起物，故依然存在急變可能，遂做以下研究。

1材料與方法

1.1標(biāo)本

1.1.1骨髓患者取左側(cè)屈膝臥位，以右側(cè)髂后上脊為穿刺點(diǎn)，常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因逐層麻醉后，持穿刺針旋轉(zhuǎn)進(jìn)針獲落空感，拔出針芯，抽取骨髓大約 5 ml。其中0.2 ml用于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)，3 ml用于染色體核型分析，1 ml用于檢測(cè)BCR-ABL融合基因，另外1 ml用于檢測(cè)SRY基因。另外收集正常男性和女性的外周血各1 ml。

1.1.2皮膚結(jié)節(jié)患者取平臥位，常規(guī)消毒鋪巾，以2%利多卡因在大腿內(nèi)側(cè)皮膚結(jié)節(jié)處作局部浸潤(rùn)麻醉，麻醉滿意后在皮膚結(jié)節(jié)周圍做梭形切口，切除皮膚及皮下組織，止血滿意，縫合切口，組織送病理活檢。

1.2方法

1.2.1骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析抽取0.2 ml骨髓，立即涂片于2張潔凈的載玻片上，自然干燥。一張涂片瑞氏染色后，在普通光學(xué)顯微鏡下連續(xù)分類計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，分別計(jì)算各系統(tǒng)各階段細(xì)胞的百分率。另外一張進(jìn)行NAP染色，計(jì)算NAP陽性率和NAP積分。

1.2.2骨髓細(xì)胞染色體核型分析抽取3 ml骨髓，肝素抗凝，計(jì)數(shù)后按2×106/L接種于骨髓培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，收獲細(xì)胞，低滲，滴片，顯帶，吉姆薩染色，按照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名的國(guó)際體制》(2009版)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該患者的染色體核型進(jìn)行分析。

1.2.3骨髓BCR-ABL融合基因檢測(cè)及ABL激酶區(qū)突變位點(diǎn)篩查 提取骨髓細(xì)胞RNA，送四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心做BCR-ABL融合基因檢測(cè)和ABL激酶區(qū)突變位點(diǎn)篩查。

1.2.4SRY基因檢測(cè)采用天根生化科技有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照說明書步驟提取患者骨髓細(xì)胞、一例正常男性和一例正常女性外周血DNA，分別做SRY基因檢測(cè)。SRY基因擴(kuò)增引物[1]：Forward：5′-CGAACTCTGGCACCTTTCAA-3′，Reverse:5′-GTTACCCGATTGTCCTACAGCT-3′，目標(biāo)片段677 bp。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×master mix 12.5 μl,Forward primer 0.5 μl,Reverse primer 0.5 μl,ddH2O 10.5 μl,DNA template 1 μl。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 10 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中，恒壓160伏電泳20 min后，于凝膠成像儀中拍照。

1.2.5皮膚疣狀突起物活檢皮膚疣狀突起物組織石蠟切片后，嚴(yán)格按照HE染色的步驟制片，在普通光學(xué)顯微鏡下對(duì)該患者組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。

2結(jié)果

2.1骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)

骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)提示，粒：紅=31.3，原始粒細(xì)胞占3.4%，早幼粒細(xì)胞占4.2%，中性中幼粒細(xì)胞占17.7%，中性晚幼粒細(xì)胞占18.5%，中性桿狀核粒細(xì)胞占12.6%，中性分葉核粒細(xì)胞占15.1%，嗜酸性分葉核粒細(xì)胞占4.2%，嗜酸性分葉核粒細(xì)胞占3.4%，中幼紅細(xì)胞占1.7%，晚幼紅細(xì)胞占0.8%，成熟漿細(xì)胞占0.8%；NAP陽性率為4%，NAP積分為4分，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)符合慢性粒細(xì)胞白血病的特征(圖1)。

2.2骨髓細(xì)胞染色體核型

按照ISCN2009的標(biāo)準(zhǔn)，分析20個(gè)中期分裂相，所見核型均為47，X，-Y ，+8，t(9:22)(q34；q11)，+der(22)t(9；22)[20](圖2)。

圖1　患者骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)(瑞氏染色，10×100倍)

圖2　患者骨髓細(xì)胞染色體核型

2.3骨髓細(xì)胞BCR-ABL融合基因檢測(cè)ABL激酶區(qū)突變位點(diǎn)篩查

四川金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心檢測(cè)BCR-ABL融合基因結(jié)果提示，BCR-ABL融合基因P210型陽性(熒光定量PCR法)，并且ABL激酶區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)(直接測(cè)序法)。

2.4骨髓細(xì)胞SRY基因檢測(cè)

骨髓細(xì)胞SRY基因檢測(cè)結(jié)果顯示，患者骨髓細(xì)胞與正常男性SRY基因擴(kuò)增產(chǎn)物在677bp處可見一條均一的條帶，而女性對(duì)照和陰性對(duì)照無此條帶，故該患者骨髓細(xì)胞SRY基因陽性(圖3)。

2.5皮膚結(jié)節(jié)病理檢查

HE染色后病理檢驗(yàn)結(jié)果提示，左上肢及雙下肢疣狀突起物為纖維瘤(圖4)。

3討論

CML是迄今發(fā)現(xiàn)的第一例與染色體異常直接相關(guān)的惡性腫瘤，90%左右的患者存在由9號(hào)和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂相互易位而產(chǎn)生的特征性Ph染色體和(或)BCR-ABL融合基因[2]。BCR-ABL編碼的P210蛋白具有酪氨酸激酶活性，其使信號(hào)通路異常激活，MYC和BCL2轉(zhuǎn)錄增加，使造血干細(xì)胞增殖失控，凋亡受阻，細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。Ph染色體或BCR-ABL融合基因是CML患者重要的診斷、治療和預(yù)后標(biāo)志。

圖3患者SRY基因檢測(cè)

圖4　患者皮膚結(jié)節(jié)病理切片(HE染色，10×40倍)

CML慢性期可以持續(xù)的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，病情相對(duì)穩(wěn)定；而急變期病情兇險(xiǎn)，預(yù)后較差。本例患者左上肢及雙下肢出現(xiàn)棕色疣狀突起物，形似綠色瘤，但病理活檢提示為纖維瘤。同時(shí)，未發(fā)現(xiàn)血小板進(jìn)行性增高或降低，也未發(fā)現(xiàn)脾進(jìn)行性增大，故目前排除慢粒急變，該患者依然處于CML慢性期。實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)，該患者BCR-ABL融合基因陽性，并且ABL激酶區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，故目前該患者治療上甲磺酸伊馬替有效，故繼續(xù)甲磺酸伊馬替尼控制白血病數(shù)量，堿化尿液，抑制尿酸生成等治療。

骨髓染色體核型分析提示患者存在-Y、+8和+Ph染色體等額外的染色體異常。CML慢性期出現(xiàn)額外染色體異常約為7%，而在加速期或急變期可達(dá)到40%-70%[3,4]，故CML出現(xiàn)額外染色體異常時(shí)常常提示疾病可能進(jìn)展[5]。+8是CML、急性粒細(xì)胞白血病、骨髓異常增生綜合征、急性淋巴細(xì)胞白血病等疾病中最常見的數(shù)目異常，其中以CML患者出現(xiàn)+8的頻率最高[6]，并且+8也是CML患者最主要的額外染色體異常，經(jīng)常伴有其他額外染色體，比如+Ph[7]。+8，+Ph，+19，i(17q)等是CML加速期或者急變期最典型的染色體畸變，經(jīng)常先于臨床急變期2-4個(gè)月，并且預(yù)后較差[8-10]。

此外，-Y也是CML患者一種額外的染色體異常，研究發(fā)現(xiàn)，3.6%左右的CML患者可以檢測(cè)出骨髓細(xì)胞Y染色體的丟失[7]。本例患者骨髓細(xì)胞染色體核型分析提示Y染色體的丟失，但是PCR結(jié)果提示SRY基因陽性，一方面骨髓中部分腫瘤細(xì)胞可能存在Y染色體，因?yàn)槿旧w核型僅僅分析了20個(gè)中期分裂相，檢測(cè)能力有限；另一方面可能是骨髓中也存在部分正常細(xì)胞，雖然粒系增生明顯活躍(?！眉t=31.3∶1)，而紅系、淋巴系增生受抑，但依然可能產(chǎn)生正常的紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，SRY基因也可呈陽性。

綜上所述，雖然臨床表現(xiàn)和骨髓形態(tài)學(xué)均提示該患者目前處于CML慢性期，但是骨髓染色體核型分析發(fā)現(xiàn)存在額外的染色體異常，特別是雙Ph染色體，因?yàn)槿旧w異常可以先于臨床表現(xiàn)數(shù)月，故該患者在堅(jiān)持目前的治療外，應(yīng)盡早進(jìn)行骨髓移植，同時(shí)應(yīng)該定期復(fù)查血常規(guī)、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)以及染色體核型，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)CML急變并采取相應(yīng)的治療措施，從而延長(zhǎng)患者的生存期，改善患者的生活質(zhì)量。

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1泳道：CML患者；2泳道：正常男性對(duì)照；3泳道：女性對(duì)照；4泳道：陰性對(duì)照2.5 皮膚結(jié)節(jié)病理檢查

文章編號(hào)：1007-4287(2016)05-0843-03

作者簡(jiǎn)介：馬強(qiáng)(1987-)，男，檢驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：腫瘤的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)；郭曉蘭，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槟[瘤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

(收稿日期：2014-10-17)