范　琳，孟赫禹，孟繁波*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.延邊大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

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*通訊作者

PRKCI基因在急性心肌梗死患者外周血白細胞中低表達及其臨床意義

范琳1，孟赫禹2，孟繁波1*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.延邊大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院)

心肌梗死的發(fā)病率越來越高，且有年輕化的趨勢。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，基因的堿基突變可能是導(dǎo)致急性心肌梗死發(fā)生的原因之一[1-5]。課題組基因芯片研究發(fā)現(xiàn)，有559個基因在急性心肌梗死患者中的表達發(fā)生改變[6]。其中，PRKCI基因為顯著低表達，P=0.003517699，LogFC=-1.563554087。本研究擬在RNA水平及蛋白水平研究PRKCI基因在中國東北漢族急性心肌梗死患者中的表達，并對該基因的功能進行分析。

1對象與方法

1.1研究對象

隨機選取2014年11月-2015年1月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療的20例急性心肌梗死患者為實驗組，20例健康者為對照組，并對其病史、合并癥、生化檢查等相關(guān)臨床資料進行詳細記錄及分析。急性心肌梗死的診斷不但要符合美國心臟病協(xié)會及美國心臟病學(xué)基金會于2012年公布的診斷條件[7]，同時要經(jīng)過冠狀動脈造影術(shù)以進一步證實有明確的血管病變。符合診斷指南并存在血管嚴(yán)重狹窄或閉塞的為實驗組，不符合診斷指南且血管狹窄<50%的為對照組。

1.2研究方法

1.2.1外周血淋巴細胞獲取抽取各研究對象晨起空腹外周血6 ml于EDTA抗凝管中，于4℃保存，并在樣本采集4 h內(nèi)進行淋巴細胞提取，所用試劑為人外周血淋巴細胞分離液。在提取外周血淋巴細胞時，每位研究對象外周血標(biāo)本分為2部分，一部分4 ml用于提取總RNA，另一部分2 ml用于提取淋巴細胞內(nèi)總蛋白。詳細步驟如下：1)取新鮮抗凝血與等體積0.9%氯化鈉注射液混勻；2)將上訴混合液小心加至等體積人外周血淋巴細胞分離液上，3 000 r/min離心20 min；3)離心后由上至下分4層，分別為血漿層、乳白色淋巴細胞層、透明分離液層、紅細胞層。將淋巴細胞層吸出用于后續(xù)試驗。

1.2.2外周血淋巴細胞cDNA合成①利用血液總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)，對所得淋巴細胞進行總RNA提取。提取過程中嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，以免RNA受到降解或污染。得到RNA溶液后利用瓊脂糖電泳對RNA的質(zhì)量進行檢測。符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本利用分光光度計測定濃度，濃度符合反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求后再進行反轉(zhuǎn)錄；②依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，上海)說明書對符合實驗要求的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，每個樣品所加RNA量保持一致。得到的cDNA樣品于-80℃保存，不得反復(fù)凍融，以便下一步進行熒光定量PCR檢測。

1.2.3外周血淋巴細胞總蛋白提取將由2 ml外周血提取得到的淋巴細胞溶液12,000 r/min離心10 min，棄上清液，離心管底可見白色團塊即為淋巴細胞。每個樣品加入RIPA裂解液50 μl及蛋白酶抑制劑0.5 μl，冰上放置1 h后，12,000 r/min離心10 min，上清液即為總蛋白溶液。利用分光光度計對總蛋白溶液濃度進行檢測。所得樣本保存于-80℃，將所有樣品的濃度調(diào)至同一水平，以便下一步進行Western Blot檢測。

1.2.4RT-PCR檢測將得到的cDNA樣本稀釋10倍后，利用SYBR熒光定量試劑盒(TaKaRa,大連)進行PCR擴增。反應(yīng)條件為95℃10 min；以下三步40個循環(huán)：95℃15 s,60℃ 20 s,72℃ 20 s；95℃ 1 min，55℃ 30 s,95℃ 30 s。以GAPDH基因為內(nèi)參基因，PRKCI基因為目的基因，擴增條件的特異性根據(jù)Mx3005P儀器所帶軟件溶解曲線判定，所用PCR引物序列見表1。

表1　RT-PCR引物序列

1.2.5Western Blot檢測

將得到的總蛋白樣本使用經(jīng)典的濕轉(zhuǎn)法Western Blot進行檢測，β-actin為內(nèi)參基因，PRKCI為目的基因。根據(jù)β-actin和PRKCI蛋白分子量大小，選用10%分離膠進行電泳。所用抗體中，一抗均為兔源性抗人源性，二抗為羊源性抗兔源性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)選擇獨立樣品T檢驗，計數(shù)數(shù)據(jù)選擇χ2檢驗。若檢驗所得P<0.05，則實驗組與對照組間數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

2.1研究對象基本資料分析

研究對象基本資料分析見表2。在年齡、性別、合并癥等方面，兩組未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在LDL-C上，急性心肌梗死組明顯高于對照組，P=0.044。在HDL-C上，急性心肌梗死組明顯低于對照組，P=0.004。

表2　研究對象基本資料

2.2RT-PCR結(jié)果分析

本研究中，目的基因及內(nèi)參基因的溶解曲線均為單峰型，未見多個波峰。說明擴增引物特異性較強，反應(yīng)條件合適，未出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物(見圖1)。RT-PCR所得結(jié)果每個樣本均重復(fù)檢測3次，并且標(biāo)準(zhǔn)差符合RT-PCR要求。采用2-ΔΔCt方法計算PRKCI基因的相對表達量。結(jié)果顯示在mRNA水平上，急性心肌梗死組PRKCI基因相對表達量為對照組的0.62±0.11，P=0.032(見表3)，同基因芯片中PRKCI基因表達減低是一致的[23]。

表3　各樣本RT-PCR的CT值

ΔΔCT=急性心肌梗死組ΔCT — 對照組ΔCT；CT值指循環(huán)數(shù)，單位為倍。

2.3Western Blot結(jié)果分析

本研究中，以β-actin為內(nèi)參基因，PRKCI為目的基因。Western Blot結(jié)果顯示：急性心肌梗死組與對照組在β-actin蛋白表達上無明顯差異，說明兩組所加的蛋白樣品總量相當(dāng)。在總蛋白樣品相同的條件下，兩組在PRKCI蛋白表達上出現(xiàn)顯著差異，急性心肌梗死組PRKCI蛋白表達明顯減低(見圖2)。Western Blot結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，說明PRKCI基因不但在RNA水平上表達減低，并且導(dǎo)致PRKCI蛋白生成減少，并最終影響PRKCI蛋白參與調(diào)節(jié)的生物過程的功能失調(diào)。

A：內(nèi)參基因GAPDH的溶解曲線；B：候選基因PRKCI的溶解曲線。

1-3為對照組，4-6為急性心肌梗死組。

3討論

本課題組前期的基因芯片實驗發(fā)現(xiàn)，PRKCI基因在急性心肌梗死患者外周血白細胞中顯著低表達。本研究通過擴大樣本量確定PRKCI基因在中國東北漢族急性心肌梗死患者中表達減低，在RNA及蛋白水平均檢測到該基因顯著低表達。

PRKCI基因?qū)儆诘鞍准っ窩家族，該家族基因參與多種細胞反應(yīng)，在早期對多種生物過程的發(fā)生產(chǎn)生重要影響[8，9]。K-ATP通道在動作電位的形成、冠狀動脈擴張等過程中均發(fā)揮重要作用。在心肌組織，蛋白激酶C可激活K-ATP通道。K-ATP通道異常調(diào)節(jié)導(dǎo)致心肌缺血后多種并發(fā)癥的發(fā)生，例如心律失常[10-12]。Bandyopadhyay等發(fā)現(xiàn)[13，14]，PRKCI基因通過胰島素介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)血糖代謝。

在胰島素通路中，根據(jù)日本基因與基因組百科全書網(wǎng)站通路分析(http://www.kegg.jp/pathway/hsa04910)，胰島素與胰島素受體結(jié)合后激活PIP3及脯氨酸定向的蛋白激酶 1(PDPK1)，這兩者的激活進一步活化PRKCI蛋白，活化的PRKCI蛋白通過間接激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBP-1C) 及脂肪酸合酶(FAS)而間接促進脂肪生成,同時促進乙酰輔酶A羧化酶α與葡萄糖的吸收。此外，脯氨酸定向的蛋白激酶 1可以使蘇氨酸蛋白激酶3(Akt3)磷酸化，后者可通過抑制cAMP的合成從而抑制脂肪代謝。另一方面活化的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1可以間接激活丙酮酸激酶(PYK)與葡萄糖激酶(GK)，而后兩者通過糖酵解途徑降低血糖。

根據(jù)KEGG進行通路分析發(fā)現(xiàn)，PRKCI蛋白的正常表達有利于促進脂肪生成、葡萄糖的降解、血小板的聚集，因此PRKCI蛋白低表達的人群應(yīng)具有較低的血脂水平及較高的血糖水平。但現(xiàn)階段業(yè)界普遍認(rèn)為急性心肌梗死患者低密度脂蛋白膽固醇偏高，與此通路分析相矛盾。但是，在前期細胞實驗中，我們利用RNA干擾載體特異性干擾離體大鼠心肌細胞，并以非干擾組細胞為對照，使實驗組PRKCI基因RNA及蛋白表達均減低而不影響其他基因表達。觀察發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PRKCI基因干擾組培養(yǎng)基中LDL含量隨著時間改變濃度逐漸增高[15]，與此同時對照組培養(yǎng)基中LDL含量未見明顯改變。這說明PRKCI基因的低表達促進脂質(zhì)合成。

在本研究中，急性心肌梗死組患者低密度脂蛋白膽固醇水平較對照組高，這與先前細胞干擾結(jié)果相同，并與臨床大數(shù)據(jù)相符。急性心肌梗死組高密度脂蛋白膽固醇偏低，也與目前業(yè)界普遍認(rèn)為此為保護介質(zhì)，有利于抗血管粥樣硬化的形成。根據(jù)通路分析，PRKCI基因表達減低的患者應(yīng)具有較高的血糖水平，本研究中急性心肌梗死組患者血糖平均水平較對照組高，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，需在細胞實驗上進一步明確。急性心肌梗死組與對照組相比血小板計數(shù)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，而PRKCI基因影響血小板聚集，但由于本實驗未進行血小板功能的檢測，此現(xiàn)象仍需進一步研究。

近年來，疾病的個體化治療逐步被廣大醫(yī)學(xué)界重視，有針對性的個體化治療也會大大提高患者治療的有效性。本研究基于前期基因芯片結(jié)果，通過臨床易于獲取的血標(biāo)本對急性心肌梗死患者PRKCI基因表達進行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在急性心肌梗死患者中表達減低，其低表達促進血清低密度脂蛋白膽固醇的合成進而誘發(fā)冠狀動脈粥樣硬化，成為急性心肌梗死的病因之一。PRKCI基因可能作為急性心肌梗死診斷的分子標(biāo)記，也可能作為治療的靶點對臨床診療提供幫助。

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基金項目：2008年教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才；2009年吉林省科技廳資助項目(20090734)；2012年吉林省財政廳資助項目(2012009)

文章編號：1007-4287(2016)05-0810-04

(收稿日期：2015-05-14)