楊鴻林,沈國榮,沈　昊,鈕麗萍,錢建平,龔燕萍,蔣廷旺，殷　雄*

(1.江蘇省吳江區(qū)第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 吳江215200；2.江蘇省常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇 常熟215500)

?

*通訊作者

GP210與原發(fā)性膽汁性肝硬化患者TLR3表達(dá)的關(guān)系及其臨床意義

楊鴻林1,沈國榮1,沈昊1,鈕麗萍1,錢建平2,龔燕萍2,蔣廷旺2，殷雄2*

(1.江蘇省吳江區(qū)第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 吳江215200；2.江蘇省常熟市醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，江蘇 常熟215500)

摘要：目的探討原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)患者外周血細(xì)胞TLR3的表達(dá)及其在GP210抗體陽性和陰性患者之間的表達(dá)差異。方法選擇初次確診的PBC患者65例，其中男15例，女50例。GP210抗體陽性患者21例，陰性患者44例。對照組選擇性別和年齡相匹配的慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)患者22例。對所有患者分離外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood monuclear cell,PBMC)，抽提總RNA，定量PCR分析其TLR3的mRNA表達(dá)水平。分別以anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8和anti-TLR3抗體對PBMC進(jìn)行染色，流式細(xì)胞術(shù)分析各細(xì)胞亞群中TLR3的表達(dá)情況。結(jié)果PBC組患者血清堿性磷酸酶(ALP)顯著高于CHB組(P=0.002)，而且GP210陽性PBC患者ALP高于陰性患者(P=0.004)。PCR結(jié)果表明，PBC組PBMC中TLR3的mRNA表達(dá)量顯著高于CHB組(P=0.01)，而且PBC組內(nèi)GP210陽性患者表達(dá)高于陰性患者的表達(dá)水平(P<0.001)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBC組PBMC、CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞表面的TLR3表達(dá)量均顯著高于CHB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中PBC組GP210陽性患者PBMC、CD3+ 和CD8+ T細(xì)胞表達(dá)量較GP210患者均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而CD4+ T細(xì)胞無顯著差異(P>0.05)。結(jié)論GP210陽性PBC患者中PBMC和T細(xì)胞表面TLR3的基因和蛋白表達(dá)水平均高于GP210陰性患者，TLR3的表達(dá)差異對于PBC的診斷和預(yù)后判斷具有一定臨床價值。

關(guān)鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化；GP210；Toll樣受體3；T細(xì)胞

(ChinJLabDiagn,2016,20:0775)

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝病，好發(fā)于成年女性，以肝內(nèi)小膽管破壞為早期病變特征，最終引起肝纖維化和肝硬化[1]?？笹P210抗體是近年來發(fā)現(xiàn)的對于PBC具有較高診斷價值的一種抗核抗體，研究發(fā)現(xiàn)其診斷特異性達(dá)到99.5%，但是其靈敏度相對較低，約為22.5%[2]。同時有研究證實(shí)GP210陽性PBC患者的病情較陰性患者更為嚴(yán)重，如膽汁淤積明顯、小葉性炎癥等病理損傷加劇[3]。

Toll樣受體3(Toll-like receptor-3,TLR3)的眾多生物學(xué)效應(yīng)是在炎癥反應(yīng)過程中通過其信號通路活化后完成的。盡管TLR3主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞中介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，但是已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)其在多種適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞中也有表達(dá)，如抗原誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞等[4,5]。但是TLR3在PBC患者T細(xì)胞中的表達(dá)及其與GP210存在怎樣的聯(lián)系目前并不明確，本研究將就此進(jìn)行探討。

1資料與方法

1.1研究對象

選擇常熟市第二人民醫(yī)院門診或住院的PBC初次確診患者65例，平均年齡58.1±9.3歲，其中男15例，女50例。其中GP210抗體陽性患者21例，陰性患者44例。PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)為[6]：1)堿性磷酸酶(ALP)持續(xù)升高超過6個月；2)抗線粒體抗體(AMA)陽性；3)肝組織病理發(fā)現(xiàn)匯管區(qū)炎性浸潤或小膽管破壞。滿足以上三項中的任意兩項即可診斷為PBC。排除其他自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝硬化、藥物性肝炎患者。對照組選擇慢性乙型肝炎患者(Chronic hepatitis B,CHB)22例，平均年齡57.3±8.5歲，其中男5例，女17例。

1.2方法

1.2.1TLR3基因測定

收集各組患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood monuclear cells,PBMCs)，抽提細(xì)胞總RNA，根據(jù)基因庫中人TLR3和β-actin的mRNA序列合成引物，以SYBR-Green法定量分析上述基因表達(dá)。TLR3上游引物：5’-TGAGTTAGATATGCGCTTTA-3’,下游引物：5’-TCAGGGATGTTGGTAT GG-3’；β-actin上游引物：5’-GAAATCTGTCAAAGTTCA-3’，下游引物：5’-AGGCAGCTCGTAGCTCTT-3’。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為：25℃ 10 min、48℃ 30 min、95℃ 5 min。在ABI Prism7000定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，讀取閾循環(huán)值(threshold cycle，Ct)，根據(jù)公式：ΔCt = [Ct (目的基因)]-[Ct (內(nèi)參基因)]和ΔΔCt =[ΔCt (研究組) ]-[ΔCt (對照組) ]，計算出2-ΔCt，以反映出目的基因在研究組中表達(dá)水平(相對于對照組)。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)分析TLR3

分離PBMCs，并將其以PBS稀釋至1×106/100 μl，將其分別與20 μl的anti-CD3、anti-CD4、anti-CD8(BD,USA)等抗體進(jìn)行室溫避光孵育30 min。然后將上述細(xì)胞分別與anti-TLR3(BD,USA)進(jìn)行避光孵育，最后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，以flowjo軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.3統(tǒng)計方法

2結(jié)果

2.1患者基本資料

表1為PBC和CHB患者實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，其中年齡、AST、GGT、LDH兩組間差別無統(tǒng)計學(xué)意義，而CHB組患者ALT較PBC組有所增加，而ALP則顯著低于PBC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表2為PBC患者中GP210陽性患者和陰性患者的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，其中ALT、AST、GGT和LDH差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是GP210陽性組ALP水平顯著高于GP210陰性組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　PBC和CHB患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

表2　　　GP210陽性和GP210陰性PBC患者實(shí)驗(yàn)室

2.2TLR3基因表達(dá)情況

定量PCR對PBC和CHB患者外周血單個核細(xì)胞TLR3相對于β-actin的mRNA表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)：PBC組和CHB組分別為1.71±0.81和1.22±0.54，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.01，t=6.96)；PBC組內(nèi)GP210陽性患者和GP210陰性患者表達(dá)量分別為2.10±0.84和1.66±0.76，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，t=16.5)。

圖1各組患者PBMC中TLR3基因相對表達(dá)水平，圖1A)：PBC患者和CHB患者PBMC中TLR3基因表達(dá)水平；圖1B)：GP210陽性和陰性PBC患者PBMC中TLR3基因表達(dá)水平

2.3TLR3在外周血不同亞群細(xì)胞表面的表達(dá)情況

以流式細(xì)胞術(shù)對PBC和CHB患者外周血PBMCs、CD3+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞表面TLR3的表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PBC組PBMC、CD3+ T、CD4+ T、CD8+ T細(xì)胞的TLR3表達(dá)百分比分別為12.8%(8.4%-24.5%)、11.5%(6.3%-25.7%)、5.5%(3.2%-7.2%)、4.7%(3.3%-8.5%)；CHB組分別為4.8%(1.5%-10.2%)、2.0%(1.1%-3.2%)、2.6%(0.8%-4.5%)、1.3%(0.9%-2.1%)。GP210陽性組不同細(xì)胞TLR3表達(dá)量為14.2%(8.4%-25.4%)、12.2%(9.6%-22.5%)、5.6%(3.2%-7.6%)、8.5%(6.2%-9.6%)、5.8%(4.2%-7.6%)；GP210陰性組分別為10.1%(6.5%-14.2%)、7.8%(3.6%-14.2%)、7.5%(5.3%-8.6%)、5.8%(4.2%-7.6%)。如圖2所示：PBC組不同細(xì)胞亞群表面的TLR3表達(dá)量均顯著高于CHB組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；其中PBC組GP210陽性患者PBMC、CD3+ 和CD8+ T細(xì)胞表達(dá)量較GP210患者均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而CD4+ T細(xì)胞無顯著差異。

圖2各組患者不同細(xì)胞亞群表面TLR3表達(dá)情況，圖2A)PBC和CHB患者外周血不同細(xì)胞TLR3表達(dá)情況；圖2B)GP210陽性和陰性PBC患者PBMC中TLR3表達(dá)水平。

3討論

T細(xì)胞在多種肝臟炎癥及實(shí)質(zhì)性病變過程中均發(fā)揮重要作用，但是也有很多研究提示，單獨(dú)的自身反應(yīng)性T細(xì)胞不足以直接引起組織損傷，還需要一些其他的介導(dǎo)炎性反應(yīng)的信號分子[7]。基于自身免疫性疾病小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，TLR3的活化能夠加劇病情，并導(dǎo)致自身反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的增加[8]。

細(xì)胞免疫在PBC匯管區(qū)病理損傷過程中具有重要作用，其中CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞在匯管區(qū)的大量浸潤表明其在PBC膽管上皮細(xì)胞損傷中通過介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)揮主導(dǎo)作用。TLR樣受體在各種炎性疾病中均發(fā)揮重要作用，不僅通過適應(yīng)性免疫應(yīng)答，而且作用于天然免疫系統(tǒng)，還可以誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答參與免疫炎癥的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者外周血單個核細(xì)胞TLR3的mRNA表達(dá)較慢性肝炎組顯著升高。研究已經(jīng)證明TLR3通過激發(fā)適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答在抗病毒過程中具有重要作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)PBC患者TLR3的表達(dá)較HBV慢性感染者明顯升高，提示TLR3在PBC疾病的進(jìn)程中可能具有十分重要的作用。進(jìn)一步對GP210陽性和陰性患者分析發(fā)現(xiàn)，GP210陽性患者的TLR3表達(dá)高于GP210陰性患者。盡管GP210的陽性率沒有AMA高，但是其在PBC的診斷中具有很高的特異性，近年來的研究越來越提示其對于PBC的高診斷價值[10]。對于GP210對PBC疾病本身的影響國內(nèi)外也有較多研究，Nakamura等研究發(fā)現(xiàn)，GP210陽性和陰性患者的生化參數(shù)并無顯著差別，但是Muratori等人卻發(fā)現(xiàn)GP210陽性患者膽汁淤積癥狀和肝損傷情況明顯加劇[11,3]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)PBC患者中GP120陽性和陰性患者的肝功能大部分都無統(tǒng)計學(xué)差異，而反映膽汁淤積的ALP則GP210組明顯升高，這與國外同類研究基本一致。而GP210陽性組TLR3表達(dá)升高可能說明這部分患者中TLR3介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答明顯增強(qiáng)，可能通過該途徑加劇了PBC疾病的進(jìn)程和肝臟損傷程度。

T細(xì)胞是引起PBC膽管上皮細(xì)胞損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞[6]。為了進(jìn)一步明確PBC患者中TLR3在不同免疫細(xì)胞中的表達(dá)情況，我們以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PBC患者PBMC、CD3+T、CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面的TLR3表達(dá)量均高于CHB患者組，說明TLR3的活化對T細(xì)胞介導(dǎo)的PBC病理損傷可能發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Meyer T等人在對T細(xì)胞的體外研究發(fā)現(xiàn)，TLR3的活化與CD3共同作用促進(jìn)CD4+T細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的釋放，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[12]。因此，PBC患者T細(xì)胞表面TLR3表達(dá)的升高可能使得T細(xì)胞在PBC微環(huán)境中的炎癥介質(zhì)釋放顯著增加，從而加劇病理損傷和肝纖維化、肝硬化的病程進(jìn)展。對GP210陽性和陰性患者進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，除CD4+T細(xì)胞之外，其他細(xì)胞TLR3的表達(dá)GP210陽性組均高于陰性組。提示GP210陽性患者T細(xì)胞中TLR3活化程度明顯升高，CD4+T細(xì)胞表達(dá)沒有改變而CD8+T細(xì)胞表達(dá)顯著升高可能與PBC的病理特征存在關(guān)聯(lián)性，因?yàn)镻BC患者的膽管上皮細(xì)胞自身免疫性損傷主要由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)，而GP210陽性患者CD8+T細(xì)胞TLR3表達(dá)升高印證了這一點(diǎn)，同時也說明TLR3的升高對于PBC病情加劇具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究從基因和蛋白水平分別發(fā)現(xiàn)TLR3在PBC患者中表達(dá)顯著升高，而GP210陽性患者中的表達(dá)較陰性患者明顯增加，T細(xì)胞表達(dá)升高尤其顯著，說明GP210與TLR3在PBC中的表達(dá)存在一定聯(lián)系，且TLR3的表達(dá)異?？赡茉谝欢ǔ潭壬霞觿×薖BC的進(jìn)程。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣廷旺，韓志君，熊懷民，等.IL-27誘導(dǎo)原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血CD4+T細(xì)胞增殖分化作用機(jī)制研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2011,31(11):1023.

[2]Bandin O,Courvalin JC,Poupon R,et al.Specificity and sensitivity of gp210 autoantibodies detected using an enzyme-linked immunosorbent assay and a synthetic polypeptide in the diagnosis of primary biliary cirrhosis[J].Hepatology,1996,23(5):1020.

[3]Muratori P,Muratori L,Ferrari R,et al.Characterization and clinical impact of antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis[J].Am J Gastroenterol,2003,98(2):431.

[4]Harte MT,Haga IR,Maloney G,et al.The poxvirus protein A52R targets Toll-like receptor signaling complexes to suppress host defense[J].J Exp Med,2003,197(3):343.

[5]Tabiasco J,Devêvre E,Rufer N,et al.Human effector CD8+ T lymphocytes express TLR3 as a functional coreceptor[J].J Immunol,2006,177(12):8708.

[6]Marshall M，Kaplan M，Eric Gershwin.Primary biliary cirrhosis[J].N Engl J Med,2005,353(12):1261.

[7]Horwitz MS,Bradley LM,Harbertson J,et al.Diabetes induced by Coxsackie virus:initiation by bystander damage and not molecular mimicry[J].Nat Med,1998,4(7):781.

[8]Lang KS,Recher M,Junt T,et al.Toll-like receptor engagement converts T-cell autoreactivity into overt autoimmune disease[J].Nat Med,2005,11(2):138.

[9]Chen S,Cheng A,Wang M.Innate sensing of viruses by pattern recognition receptors in birds[J].Vet Res,2013,44:82.

[10]Granito A1,Muratori P,Quarneti C,et al.Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis[J].Expert Rev Mol Diagn,2012,12(1):65.

[11]Nakamura M,Takii Y,Komori A,et al.antibody titer to gp210-c terminal peptide as a clinical parameter for monitoring primary biliary cirrhosis[J].J Hepatol,2005,42(3):386.

[12]Meyer T,Oberg HH,Peters C,et al.poly(I:C) costimulation induces a stronger antiviral chemokine and granzyme B release in human CD4 T cells than CD28 costimulation[J].J Leukoc Biol,2012,92(4):765.

Correlation of GP210 with Expression of TLR3 in Primary Biliary Cirrhosis

YANGHong-lin,SHENGuo-rong,SHENHao,etal.

(TheFirtsHospitalofWujiangDistrict,Wujiang215200,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of TLR3 in peripheral blood of patients with primary biliary cirrhosis (PBC) and its difference in GP210 positive and negative patients.Methods65 patients with PBC were involved in this study,male 15,female 50.21 patients with GP210 positive and 44 patients with GP210 negative.peripheral blood monuclear cells (PBMC) were isolated and total RNA was extracted for TLR3 mRNA determination.PBMC were stained with anti-CD3,anti-CD4,anti-CD8 and anti-TLR3,and assayed by flow cytometry.ResultsHigher levels of alkaline phosphatase (ALP) in PBC than that in CHB were found (P=0.002).GP210 positive PBC patients with higher levels of ALP than those of negative patients (P=0.004).Results of PCR showed that TLR3 mRNA in patients with PBC was higher than those with CHB (P=0.01).Furthermore,GP210 positive patients express moreTLR3 mRNA than negative patients (P<0.001).Results of flow cytometry showed that TLR3 in PBMC,CD3+,CD4+ and CD8+T cells in patients with PBC were higher than that in CHB patients (P<0.05).TLR3 in PBMC,CD3+ and CD8+ T cells in GP210 positive patients were higher than those in negative patients (P<0.05),however,no clinical significance was found in CD4+ T cells (P>0.05).ConclusionmRNA and protein levels of TLR3 in PBMC and T cells of GP210 positive patients were significantly higher than that in GP210 negative patients,which maybe in diagnosis and prognosis in PBC.

Key words:primary biliary cirrhosis;GP210;TLR3;T cells

基金項目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃子任務(wù)：2014AA022304)，常熟市科技發(fā)展計劃社會發(fā)展項目(CS201218，CS201313，CS201417)

文章編號：1007-4287(2016)05-0775-05

中圖分類號：R575.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

作者簡介：楊鴻林(1977-)，男，碩士，主要從事肝病的發(fā)病機(jī)制研究。

(收稿日期：2015-11-24)