楊　麗，常笑語，石　搏

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼科，吉林 長春130041；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院2012屆；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 實驗中心)

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*通訊作者

葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中IGF-1和TNF-α表達(dá)的影響

楊麗1，常笑語2，石搏3*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼科，吉林 長春130041；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部臨床醫(yī)學(xué)院2012屆；3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 實驗中心)

摘要：目的探討不同劑量葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中IGF-1和TNF-α表達(dá)的影響。方法將90只健康清潔級Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照組(10只)、糖尿病模型組(20只)、葛根素2 mg/kg給藥組(A組，n=20只)、葛根素5 mg/kg給藥組(B組，n=20只)和葛根素10 mg/kg給藥組(C組，n=20只)。除對照組外，其它4組均腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素制備糖尿病模型；給藥方式均采用每日上午灌胃1次，3個月后處死，取各組大鼠眼球視網(wǎng)膜。采用HE染色檢測大鼠視網(wǎng)膜的病理改變；采用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中IGF-1、TNF-α的蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果與對照組相比較，糖尿病組和A組IGF-1蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低、TNF-α蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度均明顯升高，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；B組IGF-1蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度降低、TNF-α蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度升高，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組IGF-1、TNF-α蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度略降低及略升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與糖尿病組比較，A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組、C組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論葛根素能夠通過提高IGF-1的表達(dá)及降低TNF-α的表達(dá)，從而起到保護(hù)視網(wǎng)膜的功能。

關(guān)鍵詞：糖尿病；葛根素；視網(wǎng)膜；IGF-1；TNF-α；免疫組織化學(xué)

(ChinJLabDiagn,2016,20:0697)

糖尿病微血管并發(fā)癥中最常見及最為嚴(yán)重之一是糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinoathy，DR)，它是一類細(xì)胞增殖性疾病，通常其發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞增殖的調(diào)控失常有關(guān)[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，已有多種細(xì)胞因子參與了糖尿病微血管并發(fā)癥DR發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的調(diào)控，其發(fā)病機(jī)制的研究也日益受到關(guān)注。本實驗選用IGF-1、TNF-α變化作為指標(biāo)，探討糖尿病大鼠 IGF-1、TNF-α的變化及其在DR發(fā)病機(jī)制中的重要作用，為葛根素廣泛應(yīng)用于糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物分組及給藥方式購買吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動物實驗中心 (動物許可號:SCXK2007-吉大-0003)健康清潔級Wistar雄性大鼠90只，體重為240-260 g，隨機(jī)分為5組，分別為對照組(10只)、糖尿病模型組(20只)、葛根素2 mg/kg給藥組(A組，n=20只)、葛根素5 mg/kg給藥組(B組，n=20只)和葛根素10 mg/kg給藥組(C組，n=20只)。除對照組外，其它4組均腹腔注射50 mg/kg鏈脲佐菌素制備糖尿病模型；給藥方式均采用每日上午灌胃1次，3個月后處死，取各組大鼠眼球視網(wǎng)膜。

1.2實驗試劑和實驗設(shè)備葛根素購于南京正大天晴制藥公司(純度為99.8%)，用生理鹽水稀釋至實驗所需濃度備用；鏈脲佐菌素(STZ，純度100%，美國Sigma公司，配制成10 mg/ml鏈脲佐菌素溶液)；兔抗鼠IGF-1、TNF-α抗體均購于北京博奧森生物有限公司；SP9710和DAB試劑盒均購于福州邁新生物有限公司。Leica RM 2245石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)，Leica EG 1150H包埋機(jī)(德國Leica公司)，Leica HI 1210撈片機(jī)(德國Leica公司)。

1.3模型制備方法[2]清晨腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg；并于注射48 h后，清晨空腹取尾血測血糖，糖尿病模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)是血糖濃度大于16.7 mmol/L。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1各組大鼠視網(wǎng)膜的病理檢測實驗結(jié)束后次日清晨處死大鼠，每組各隨機(jī)取10個眼球固定于4%多聚甲醛液中，常規(guī)石蠟包埋，切成5 μm，進(jìn)行HE染色。

1.4.2各組大鼠視網(wǎng)膜的IGF-1和TNF-α蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度的檢測切片3 μm 2張，分別通過SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)IGF-1、TNF-α染色。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析各組大鼠視網(wǎng)膜中IGF-1和TNF-α蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度(灰度值)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用t檢驗，α=0.05。

2結(jié)果

2.1一般狀態(tài)整個實驗過程中記錄各組大鼠體重、精神狀態(tài)、毛皮的光澤度及反應(yīng)的靈敏度。對照組的一般狀態(tài)極佳；糖尿病組的一般狀態(tài)較差；葛根素從大劑量組、中劑量組到小劑量組的一般狀態(tài)從佳、較好至較差，但仍明顯好于糖尿病組。

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜的病理檢測結(jié)果對照組大鼠視網(wǎng)膜的色素上皮層、視細(xì)胞層、雙極細(xì)胞層和節(jié)細(xì)胞層均清晰可見，各層細(xì)胞排列規(guī)則、緊密無炎細(xì)胞浸潤；與對照組比較，糖尿病組各層細(xì)胞排列略微紊亂、松散且細(xì)胞質(zhì)淡染，無炎細(xì)胞浸潤；葛根素A、B和C組各層細(xì)胞排列均較為緊密、規(guī)則未見炎細(xì)胞浸潤。

2.3各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α和IGF-1蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度比較 免疫組織化學(xué)染色定性檢測TNF-α和IGF-1蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度，應(yīng)用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件半定量檢測TNF-α和IGF-1蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度的灰度值，灰度值越大蛋白陽性表達(dá)越弱，灰度值越小蛋白陽性表達(dá)越強(qiáng)。與對照組相比較，糖尿病組和A組IGF-1蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低、TNF-α蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度均明顯升高，差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；B組IGF-1蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度降低、TNF-α蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度升高，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；C組IGF-1、TNF-α蛋白的陽性表達(dá)強(qiáng)度略降低及略升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。與糖尿病組比較，A組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組、C組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；見表1和圖1、2。

表1　　　葛根素對各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α和IGF-1

注：aP<0.01,bP<0.05與對照組比較;cP<0.01與糖尿病組比較;dP<0.01與小劑量組比較;eP<0.01與中劑量組比較。

3討論

隨著人民生活水平的日益提高，糖尿病已經(jīng)成為一種新的流行性疾病，而糖尿病嚴(yán)重且常見的微血管并發(fā)癥之一是糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic RetinoPathy，DR)，DR也是導(dǎo)致失明的一個重要因素[3]。近年來許多學(xué)者[4]對細(xì)胞因子與DR發(fā)生發(fā)展的關(guān)系進(jìn)行了研究。本實驗研究通過檢測糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和胰島素樣生長因子-1 ( insulin-like growthfactor-1，IGF-1)蛋白陽性表達(dá)強(qiáng)度，探究二者在DR發(fā)病中的作用機(jī)制。TNF-α是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種重要的生物活性因子，它一方面能提高靶細(xì)胞對VEGF、TGF-β 以及IGF-1的反應(yīng)性，從而促進(jìn)新生的毛細(xì)血管及成纖維組織增生；另一方面能增加血管通透性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而加速血管的新生[5]。IGF-1是細(xì)胞增殖調(diào)控因子，在細(xì)胞的增殖、分化及個體的生長發(fā)育中具有多功能調(diào)節(jié)作用；它是一種多肽類因子具有胰島素樣作用，糖尿病患者的胰島素水平低下，導(dǎo)致血糖升高從而抑制了肝臟合成IGF-1，導(dǎo)致引起IGF-1減少，促進(jìn)細(xì)胞的增生和分化，從而抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[6]。

圖1各組大鼠視網(wǎng)膜TNF-α的病理學(xué)改變(免疫組化 ×400； A：對照組；B:葛根素大劑量組；C:葛根素中劑量組；D：葛根素小劑量組；E：模型組)

圖2各組大鼠視網(wǎng)膜IGF-1的病理學(xué)改變(免疫組化 ×400； A：對照組；B:葛根素大劑量組；C:葛根素中劑量組；D：葛根素小劑量組；E：模型組)

目前已經(jīng)證實，糖尿病狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激加劇，導(dǎo)致生長增殖加速同時細(xì)胞凋亡受到抑制，使得視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖，促進(jìn)毛細(xì)血管的不斷新生，因此導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[7]。本實驗研究結(jié)果表明，給予不同劑量的葛根素治療后，能夠提高IGF-1蛋白表達(dá)水平，降低TNF-α的蛋白表達(dá)水平，且隨劑量的增加作用增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與糖尿病組比較，葛根素小劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；葛根素中、大劑量組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示葛根素能夠通過提高IGF-1的表達(dá)及降低TNF-α的表達(dá)，調(diào)控視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展，從而起到保護(hù)視網(wǎng)膜的功能，為葛根素的臨床應(yīng)用奠定實驗基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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The influence of puerarin on the expression of IGF-1 and TNF- α in retina in diabetic rats

YANGLi，CHANGXiao-yu，SHIBo.

(DepartmentofOphthalmology,TheSecondHospitalofJilinUniversity，Changchun130041，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Puerarin on the expression of different doses of IGF-1 and TNF-α in retina in diabetic rats.Methods90 healthy clean grade Wistar male rats were randomly divided into 5 groups,which were control group (10 rats),diabetic model group (20 rats),puerarin 2 mg/kg gives the medicine group (A group,n=20 only),puerarin 5 mg/kg gives the medicine group (B group,n=20 only) and puerarin 10 mg/kg the drug group (group C,n=20).Except the control group,diabetic model of inhibin preparation of other 4 groups were injected 50 mg/kg STZ;Administration methods were adopted in the morning,1 times in the morning,3 months later,the rats were sacrificed.HE staining was used to detect the rat retina pathological change;protein positive expression intensity of IGF-1,TNF-α immunohistochemical method was used to detect rat retinal tissues.ResultsCompared with the control group,diabetes group and a group of IGF-1 protein positive expression strength were significantly lower,TNF-α protein expression intensity was significantly higher,the differences of statistical significance(P<0.01),reduce the positive expression intensity of IGF-1 protein in group B and TNF-α protein positive expression intensity increased,the difference is also statistically significant (P<0.05),C group IGF-1,TNF-α protein expression intensity decreased slightly and slightly increased,the difference was not statistically significant(P>0.05).Compared with diabetic group,a group without statistical significance(P>0.05);B group and C group,the differences were statistically significant(P<0.01).ConclusionPuerarin can raise the expression of IGF-1 and decrease the expression of TNF-α,so as to protect the function of the retina.

Key words:diabetes mellitus;puerarin;retina;IGF-1;TNF-α;immunohistochemistry

基金項目：國家自然科學(xué)基金29890280-3(2)

文章編號：1007-4287(2016)05-0697-03

中圖分類號：R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

(收稿日期：2015-12-14)