李輝+果雙雙+施振旦

摘要：為提高蛋白質的穩(wěn)定性，便于運輸和延長儲存時間，冷凍干燥是目前公認最可行的技術之一。通過對豬重組抑制素蛋白冷凍干燥后的外觀、色澤、復水性以及SDS-PAGE電泳檢測，對27種常用凍干保護性物質進行篩選。結果表明，可溶淀粉和β-環(huán)糊精的保護效果較好，表現(xiàn)在外形飽滿無坍縮、色澤細膩白亮、復溶后無沉淀、電泳檢測發(fā)現(xiàn)蛋白條帶無降解。將篩選出的2個保護劑制備成凍干樣品放置于37 ℃烘箱中，進行加速穩(wěn)定性試驗。結果表明，在37 ℃放置4個月后，凍干蛋白樣品保持形態(tài)色澤不變，復溶后無沉淀，蛋白無降解現(xiàn)象。

關鍵詞：重組豬抑制素；冷凍干燥；凍干保護劑；復水性；穩(wěn)定性

中圖分類號： Q51

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0291-03

抑制素是一種主要由雌性動物卵泡顆粒細胞和雄性動物睪丸支持細胞分泌的糖蛋白激素[1]，主要通過負反饋作用抑制垂體FSH、LH的分泌[2]。通過主動或被動免疫抑制素，可促進垂體FSH、LH分泌，從而促進動物的繁殖活動[3-6]。因此在實際生產(chǎn)中可以通過注射重組抑制素的方法，利用動物的免疫機能，降低體內(nèi)抑制素水平，提高動物生產(chǎn)力[7-8]。筆者所在實驗室在前期研究的基礎上進行了重組豬抑制素蛋白的大規(guī)模發(fā)酵制備研究，已經(jīng)制備了大量純度較高重組蛋白。但是作為一種生物制品，應用于生產(chǎn)中尚存在溶液性蛋白穩(wěn)定性差、遠距離運輸和儲存過程中受溫度影響較大等缺陷[9]，因此，常通過冷凍干燥的方法制成凍干品以避免[10]。

冷凍干燥的基本原理是將蛋白溶液在低溫下凍結，真空條件下干燥而形成固體制劑。干燥過程又分為2步：移除結晶水的初步干燥和移除結合水的二次干燥[11]。然而冷凍干燥操作本身也會影響蛋白質的穩(wěn)定性，具體在于冷凍過程和干燥過程。在冷凍過程中，主要是冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變和相分離等影響因素[12]。而在干燥過程中，尤其是在二次干燥即移除結合水的過程中，蛋白的水化膜被破壞，導致蛋白質表面的氫鍵遭到破壞，引起蛋白質天然結構發(fā)生改變，從而影響電荷分布，導致蛋白變性凝聚[9]。經(jīng)過冷凍后的蛋白質多出現(xiàn)溶解度差、生物活性下降甚至降解等問題。因此，在冷凍干燥過程中常在蛋白質溶液中添加糖類、氨基酸類、蛋白類和高分子化合物等保護劑，以減少或者阻止冷凍和干燥過程中對蛋白質的損傷[13]。

本研究著重對重組豬抑制素蛋白的凍干保護劑進行篩選，以期篩選出1種或幾種具有良好保護效果的保護劑，為實際生產(chǎn)中的大規(guī)模推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 純化重組豬抑制素蛋白溶液（濃度5 mg/mL）由筆者所在實驗室保存。其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 真空冷凍干燥機（LGJ-12，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；垂直電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon1600，上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理 將27種待測凍干保護劑按3%（m/V）比例分別添加到重組豬抑制素蛋白溶液中，待保護劑完全溶解后，用0.22 μm細菌濾器過濾除菌并分裝至1.5 mL的無菌離心管內(nèi)備用，每管1 mL。

1.2.2 凍干處理 凍干過程中有常規(guī)工藝，流程如下：（1）預凍。將分裝好的樣品，放入-80 ℃冰箱中預凍，使樣品完全結冰；同時，打開冷凍干燥機的壓縮機，使凍干機的冷阱溫度降至-50 ℃以下。（2）升華干燥。將預凍好的樣品打開蓋子，迅速放入凍干機的擱板上并蓋上真空罩，開啟真空泵抽真空，使真空度降至1 Pa，并保持12 h；待樣品完全干燥后，取出樣品蓋上蓋子，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 凍干樣品的檢測

1.3.1 外觀檢查 應以白色疏松體、骨架成型好、無坍縮、外形細致為好。

1.3.2 復水性檢查 取1 mL蒸餾水加入凍干樣品中，應以迅速溶解、無沉淀為好。

1.3.3 蛋白穩(wěn)定性檢查 取復水后的樣品進行SDS-PAGE檢測，以無降解條帶為好。

1.3.4 37 ℃加速穩(wěn)定性試驗 通過外觀、復水性和蛋白穩(wěn)定性檢查后，篩選出較好的組放入37 ℃培養(yǎng)箱中進行加速穩(wěn)定性試驗，時間為4個月，每個月定期取樣并重復上述檢測。

2 結果與分析

2.1 外觀及復水性檢查

添加凍干保護劑的凍干制品均為白色疏松體，但大部分表現(xiàn)出坍縮、中空，樣品呈絲狀或絮狀。而添加甘露醇、PEG系列、甘氨酸、磷酸氫二鈉、L-半胱氨酸、可溶淀粉和β-環(huán)糊精組表現(xiàn)出細致粉狀，不易松散，樣品表面整齊、光滑、無肉眼可見細孔。凍干樣品加水后均能迅速溶解，但有少量沉淀，僅添加可溶淀粉和β-環(huán)糊精組能徹底溶解。對照組則呈現(xiàn)出微黃色絮狀，加水后漂浮于液面之上，經(jīng)超聲波及加熱助溶后仍不溶解（表1）。上述結果說明可溶淀粉和β-環(huán)糊精對重組豬抑制素蛋白的冷凍干燥具有較好的保護作用。

2.2 蛋白穩(wěn)定性檢查

加水溶解后的樣品進行SDS-PAGE檢測，結果發(fā)現(xiàn)添加凍干保護劑的試驗組中蛋白條帶無降解（圖1）。

2.3 37 ℃加速穩(wěn)定性試驗

將篩選出的可溶淀粉和β-環(huán)糊精2組放入37 ℃烘箱進行處理。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，保存1～4個月凍干品的外觀形態(tài)、顏色、復水性以及蛋白的穩(wěn)定性無明顯變化（表2、圖2）。

3 討論

蛋白溶液類藥物的運輸和儲存對外界環(huán)境（尤其是對溫度）的要求較苛刻，因此一般須在2～8 ℃環(huán)境下儲運。而經(jīng)過干燥處理后，在保證蛋白質活性和復水性不變的前提下可降低環(huán)境溫度的影響，而且凍干后的蛋白質量較輕，可降低運輸成本。目前的干燥技術有噴霧干燥[14-15]、噴霧-冷凍干燥[16-18]、流化床干燥[19]和冷凍干燥等幾種，其中應用最廣泛的是冷凍干燥。冷凍干燥是通過抽真空而降低水的沸點，使樣品中的冰直接升華為水蒸氣的方法。因為在樣品凍結狀態(tài)，且在接近真空的條件下進行，所以冷凍干燥具有其他方法所不能比擬的優(yōu)勢，例如：保證了蛋白質的生物活性、損失少、體積不改變、凍干產(chǎn)品為多孔狀、易溶、樣品氧化少、干燥徹底等[11，20]。據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局信息，目前我國已經(jīng)批準上市的凍干蛋白類藥物產(chǎn)品有重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、注射用重組人干擾素α2b、鼠表皮生長因子、外用重組人表皮生長因子、注射用重組鏈激酶、注射用重組人白介素-2、注射用重組人生長激素、人凝血因子Ⅷ、人纖維蛋白原等。

在冷凍干燥過程中需要添加保護劑以盡可能維持蛋白的生物學活性和溶解性。關于保護劑可保護冷凍干燥中蛋白質穩(wěn)定的機制，目前主要有2種觀點：（1）具有黏性的保護劑包圍在蛋白質分子周圍，組織蛋白質的伸展和沉淀，也稱之為玻璃態(tài)假說；（2）蛋白質分子中存在著大量氫鍵，結合水通過氫鍵與蛋白質分子連接，當?shù)鞍踪|在冷凍干燥過程中失去水分后，保護劑能替代水分子，保持氫鍵的連接，使蛋白質分子不直接暴露在外，也稱之為水替代假說。目前大多數(shù)學者較認可后者。因此一些容易生成氫鍵的多羥基化合物，如糖類、多元醇、一些氨基酸、蛋白質[21-24]和鹽類等成為凍干保護劑的首選[25-26]。此外，凍干保護劑的選擇還要力求成本低廉、無污染以及配方簡單。有研究發(fā)現(xiàn)，保護劑的分子量也會影響到蛋白的凍干及凍干后蛋白穩(wěn)定性，Tonnis等對分子量從6 ku到540 ku的糖類進行研究，發(fā)現(xiàn)并非分子量越大的糖保護效果越好，而是糖鏈較柔軟易彎曲的糖類保護效果較好[9]。通過對重組豬抑制素的凍干研究，篩選出的可溶淀粉和β-環(huán)糊精具有較好的保護效果。這2種物質也常用作食品和藥品的輔料和增容劑，其具有較好保護效果可能與其空間位阻小，較容易隨蛋白質的空間結構折疊而折疊有關。NaCl在凍干過程中也起重要作用，Andrea等研究發(fā)現(xiàn)，無NaCl凍干樣品表現(xiàn)出外形致密水晶狀，凍干時間較長。當NaCl含量升高至0.3%時，凍干品呈現(xiàn)出光滑疏松的網(wǎng)狀結構，因此相對于無NaCl樣品，凍干速度更快[13]。本研究將蛋白質溶解于NaCl濃度為0.9%的生理鹽水中，凍干過程中的表現(xiàn)與Andrea等的結果一致。

我國大部分的地區(qū)夏季氣溫最高在37 ℃，在凍干蛋白藥品運輸儲存時一般不高于此溫度，因此選擇37 ℃作為加速穩(wěn)定試驗的溫度。通過試驗發(fā)現(xiàn)，凍干品37 ℃處理4個月不影響外觀及穩(wěn)定性。董世娟等在重組豬IFNα的凍干研究中發(fā)現(xiàn)添加2%～5%的甘露醇作為保護劑具有較好的保護效果，在40 ℃加速穩(wěn)定試驗3個月后，凍干品穩(wěn)定性無明顯變化[27]。鄒民吉等對重組SRH蛋白同樣在37 ℃進行加速穩(wěn)定試驗，發(fā)現(xiàn)右旋糖苷40、蔗糖和甘氨酸組成的保護劑具有較好的保護效果[28]。張雪梅等篩選出15 mmol/L精氨酸+10 mmol/L谷氨酸+4%甘露醇+1%蔗糖/海藻糖，然后放置于40 ℃處理12個月不影響蛋白穩(wěn)定性[29]。說明添加保護劑凍干后的蛋白在室溫下穩(wěn)定性很高，即便提高保存溫度，藥品的穩(wěn)定性也不受影響。

隨著基因工程技術的進步，越來越多人類急需的蛋白質藥物開發(fā)出來。針對不同的蛋白需要量身定做高效的凍干保護劑。盡管目前已經(jīng)在該領域取得了令人欣喜的進步，但是對于其保護機理仍未清晰。因此未來的主要研究方向將是攻克保護機理，然后通過對蛋白質分子的氨基酸構成以及三維空間結構的分析，對應性地設計一些高效凍干保護劑，進一步提高凍干產(chǎn)品的品質。

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