謝業(yè)焜+吳娥嬌+李冬亮+靳宇佳+詹家綏

摘要：針對(duì)現(xiàn)行馬鈴薯晚疫病菌研究中單孢子囊分離方法操作難度大、耗時(shí)久、成功率低的問題，在已有的懸浮液分離方法的基礎(chǔ)上，利用單個(gè)孢子囊含有多個(gè)游動(dòng)孢子，且每個(gè)游動(dòng)孢子遺傳物質(zhì)相同的特點(diǎn)，分離獲得單個(gè)孢子囊后，采用低溫刺激其釋放游動(dòng)孢子，形成了一套分離單個(gè)孢子囊的新方法。結(jié)果表明，改進(jìn)后的方法成功率提高了近5倍，操作時(shí)間減少了50%，同時(shí)操作難度也大大降低，是病原群體研究試驗(yàn)中快速、大批量分離單孢子囊的一種行之有效的方法。該方法成功地應(yīng)用于馬鈴薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）群體遺傳和競(jìng)爭試驗(yàn)研究。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯晚疫病菌；單孢子囊分離；孢子囊；游動(dòng)孢子

中圖分類號(hào)： S435.32

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0172-02

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的具有很強(qiáng)的破壞力的、給馬鈴薯生產(chǎn)造成極大危害的病害[1]，每年因馬鈴薯晚疫病造成的直接損失高達(dá)數(shù)10億美元[2]，因此，明確馬鈴薯晚疫病的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)化規(guī)律，對(duì)馬鈴薯晚疫病的管控十分重要。當(dāng)今研究多集中于病原菌毒力的增減，很少涉及到病原菌的生存策略[3]。在自然環(huán)境中，由于寄主資源有限，同一寄主可能會(huì)被多個(gè)病原菌侵染，病原菌之間會(huì)為了有限的資源展開競(jìng)爭[4-5]。病原菌對(duì)寄主多重侵染時(shí)會(huì)采取什么樣的繁殖策略，有什么因素會(huì)對(duì)其造成影響，目前對(duì)此眾說紛紜[6-8]。本研究旨在通過探究不同基因型的病原菌侵染同一寄主時(shí)，競(jìng)爭力有何變化，探討不同病原菌在有限的生存空間中采用何種生存策略。

本研究的技術(shù)路線為：（1）選取2個(gè)SSR等位基因位點(diǎn)有差異的自育交配型菌株；（2）兩兩單獨(dú)、兩兩混合按1 ∶1的比例接種到馬鈴薯葉片（感病品種Favorite）上，每處理重復(fù)5次；（3）接菌后第3天開始拍照，至第7天結(jié)束；（4）從2個(gè)不同菌株混合的處理中分離獲得50個(gè)孢子囊，分別培養(yǎng)，提取DNA，進(jìn)行SSR分析；（5）使用ASSESS[9]計(jì)算病斑大小與發(fā)病面積，檢驗(yàn)不同等位基因的菌株致病力強(qiáng)弱。

為了得到混合侵染后不同菌株競(jìng)爭力強(qiáng)弱的結(jié)果，必須從混合接種的葉片上分離大量的單孢子囊。而傳統(tǒng)的單孢子囊分離方法——水瓊脂平板劃線法[10]存在以下不足：（1）水瓊脂不含營養(yǎng)物質(zhì)，孢子囊萌發(fā)后無法從水瓊脂上獲取營養(yǎng)，往往難以長到黑麥培養(yǎng)基上；（2）鏡檢費(fèi)時(shí)費(fèi)力，即使操作熟練也需要花3～10 min才能完成1個(gè)單孢子囊的分離；（3）水瓊脂厚度難以控制，太厚不利于鏡檢，太薄又易碎，難以轉(zhuǎn)移到黑麥培養(yǎng)基上。由于離體的馬鈴薯葉片在被馬鈴薯晚疫病菌侵染后極易腐爛，腐爛后的葉片雜菌極多，無法進(jìn)行單孢子囊分離，而傳統(tǒng)的水瓊脂平板劃線法效率低下，無法滿足試驗(yàn)需要。為此，本試驗(yàn)在袁軍海等的研究方法[11]基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，探尋一種能夠快速、高效，適合大批量獲取單個(gè)孢子囊的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株分別于2010年、2011年采自云南省和貴州省安順市，根據(jù)省份和市區(qū)首寫字母依次編號(hào)命名為YN3和AS22。

1.1.2 黑麥培養(yǎng)基 黑麥培養(yǎng)基的制作借鑒Caten等的方法[12]：取50 g黑麥于燒杯中，用自來水沖洗干凈，加入適量去離子水，室溫下浸泡15～20 h，充分研磨后于65 ℃水浴2 h，用4層紗布過濾去渣，加熱煮沸并于濾液中加入12 g瓊脂粉，待瓊脂粉充分融化后用去離子水定容至1 L，分裝，滅菌。

1.1.3 主要器材 三目生物顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿（直徑9 cm）、玻片等。

1.2 方法

1.2.1 水瓊脂平板劃線法 先倒1層大約1 mm的水瓊脂平板，然后將孢子囊懸浮液滴在平板上，于10×10倍顯微鏡下觀察，將含有單個(gè)孢子囊的部分小心切下，用鑷子將含有孢子囊的一面朝上置于黑麥培養(yǎng)基上，封口，置于18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，及時(shí)觀察其萌發(fā)情況。

1.2.2 改進(jìn)后的分離方法 改進(jìn)后的分離方法具體操作如下：

（1）用接種針從發(fā)病的馬鈴薯葉片上挑取少許菌絲，在含有200 μL無菌水的2 mL離心管中攪拌數(shù)次，待接種針上的菌絲和孢子囊混入無菌水后，用轉(zhuǎn)速為1 500 r/min的渦旋機(jī)渦旋30 s，重復(fù)2次。隨后用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子囊懸浮液濃度，將孢子囊懸浮液濃度調(diào)整到1個(gè)/2 μL。（2）于1片載玻片上放置3個(gè)已用75%乙醇滅菌的蓋玻片，分別在3個(gè)蓋玻片上滴1滴孢子囊懸浮液，然后于10×10倍顯微鏡下鏡檢，若觀測(cè)到單個(gè)孢子囊，則在液滴上加蓋1塊0.8 cm×0.8 cm 的黑麥培養(yǎng)基，隨后將其轉(zhuǎn)移至滅菌過的空培養(yǎng)皿中，封口。（3）將培養(yǎng)皿放至4 ℃冰箱中低溫處理2～3 h，刺激孢子囊釋放游動(dòng)孢子[13]，然后轉(zhuǎn)移到11 ℃的環(huán)境存放 16～18 h，促進(jìn)游動(dòng)孢子萌發(fā)[14]，最后放置18 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～10 d。（4）待萌發(fā)的孢子囊在黑麥培養(yǎng)基塊上產(chǎn)生菌絲，在超凈工作臺(tái)中將其轉(zhuǎn)移至黑麥培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，于18 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，即可得到由單個(gè)孢子囊生長而來的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 單獨(dú)侵染與多重侵染病斑面積比較

接種后5 d，YN3菌株單獨(dú)侵染時(shí)相對(duì)病斑面積約為12%，AS22菌株單獨(dú)侵染時(shí)相對(duì)病斑面積約為7%，而將二者按相同的比例混合，進(jìn)行多重侵染時(shí)，相對(duì)病斑面積約為24%，相對(duì)病斑面積顯著增加了近2倍。

2.2 多重侵染單孢子囊分離情況

YN3菌株所占比例為57%，大于AS22菌株所占的43%，這結(jié)果符合單獨(dú)侵染時(shí)，YN3菌株的侵染力大于AS22菌株。

2.3 單孢子囊分離結(jié)果

2種單孢子囊分離結(jié)果見表1，對(duì)同一菌株采用水瓊脂平板劃線法分離100個(gè)孢子囊，最后僅能存活12個(gè)分離物，存活率僅為12%；而采用改進(jìn)后的方法分離100個(gè)孢子囊，最后能存活68個(gè)分離物，存活率達(dá)到了68%，存活率是改進(jìn)前的5.7倍。

3 討論

從試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)來看，將2個(gè)不同基因型的馬鈴薯晚疫病菌混合接種到同一葉片上，在接種量（孢子囊數(shù)量）保持一致的條件下，混合侵染后的侵染能力明顯大于單獨(dú)侵染。單獨(dú)侵染時(shí)，YN3的相對(duì)病斑面積是AS22的 1.71 倍；混合侵染的葉片上YN3的孢子囊數(shù)量是AS22的 1.33 倍。表明單獨(dú)侵染和混合侵染時(shí)，2個(gè)菌株毒力的提高大致呈相同比例，也就是說，混合侵染使得2個(gè)菌株互相競(jìng)爭，為了爭取更多的生存空間和資源，二者都提高了自身的毒力，使得自身能在競(jìng)爭中保持競(jìng)爭力，避免資源被對(duì)方完全占據(jù)而失去生存空間。

對(duì)于混合侵染時(shí)病原物的侵染力有何變化，已有眾多學(xué)者開展了研究[6-8]，前人研究結(jié)果表明，由于寄主資源有限，混合侵染會(huì)使得病原物之間的競(jìng)爭加劇，從而使得病原物的侵染力提升[4-5]。然而也有一部分試驗(yàn)觀察到，混合侵染不僅沒有使病原物的侵染力上升，侵染力相比單獨(dú)侵染時(shí)反而下降了[15]。本研究結(jié)果表明，混合侵染后病原物的侵染力出現(xiàn)顯著的提升，且二者的競(jìng)爭力關(guān)系沒有發(fā)生顯著的改變。有些試驗(yàn)的結(jié)論[15]卻與之相反，甚至在相同病原物、相同寄主的試驗(yàn)中也出現(xiàn)了這種情況[3]。今后研究要增加病原物的數(shù)量，主要是增加侵染力不同的菌株之間的競(jìng)爭情況，還有多重侵染時(shí)會(huì)發(fā)生什么情況。將來計(jì)劃除了本試驗(yàn)中使用的2株馬鈴薯晚疫病菌株，再增加2株侵染力相當(dāng)，但是與本試驗(yàn)所使用菌株有明顯差異的馬鈴薯晚疫病菌菌株，按兩兩組合、3個(gè)組合、4個(gè)組合進(jìn)行混合侵染，以便得到更為豐富的試驗(yàn)結(jié)果。

當(dāng)前所使用的單孢子囊分離方法——水瓊脂平板劃線法明顯無法滿足如此大量的分離工作。目前，針對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的單孢分離對(duì)象主要有2種，一是分離游動(dòng)孢子；二是分離孢子囊。因?yàn)橛蝿?dòng)孢子體積極小，只有配制成懸浮液方能分離。但是配制成懸浮液后，因?yàn)橛蝿?dòng)孢子體積太小，且不斷在懸浮液中游動(dòng)，鏡檢后也很難確定其位置，所以分離難度大。孢子囊相對(duì)游動(dòng)孢子大得多，而且在懸浮液液滴中不易移動(dòng)，容易鏡檢確定位置，便于分離。

污染率高、萌發(fā)率低是影響單孢子囊分離存活率的兩大主要問題。楊志輝等采用單游動(dòng)孢子的方法分離馬鈴薯晚疫病菌，平均分離率可高達(dá)51.6%[16]，如果每個(gè)游動(dòng)孢子都有這樣的分離率，一個(gè)孢子囊有6個(gè)以上的游動(dòng)孢子[17]，完全釋放后至少能有3個(gè)游動(dòng)孢子存活。根據(jù)上述思路，我們針對(duì)單個(gè)孢子囊的分離進(jìn)行改進(jìn)，用低溫刺激的方法促進(jìn)孢子囊釋放游動(dòng)孢子，進(jìn)而利用游動(dòng)孢子的數(shù)量來提升存活率。

改進(jìn)后方法相比較于水瓊脂平板劃線法，主要改進(jìn)之處是操作難度降低，工作效率和存活率提高。水瓊脂平板劃線法首先要鏡檢，要找到一處只有單個(gè)孢子囊的地方，然后還要在顯微鏡下劃線切割，該過程如果操作不當(dāng)很容易把多余的孢子囊也切割下來。劃線切割完成后還要用鑷子轉(zhuǎn)移水瓊脂塊，為了方便鏡檢，水瓊脂平板一般都倒得很薄，所以鑷子很容易把水瓊脂捏碎，即轉(zhuǎn)移操作難度較大，改進(jìn)后的方法克服了這一難題。同時(shí)，改進(jìn)后的方法鏡檢快，只需要檢查液滴上是否有單個(gè)孢子囊。鏡檢后操作也很簡單，只需要在液滴上加蓋1塊0.8 cm×0.8 cm的黑麥培養(yǎng)基，再轉(zhuǎn)移到空的培養(yǎng)皿中即可。從實(shí)際操作時(shí)間來看，改進(jìn)后的方法大大節(jié)省了操作時(shí)間，提高了工作效率，為馬鈴薯晚疫病菌甚至致病疫霉的群體研究帶來了極大便利。

參考文獻(xiàn)：

[1]Akino S，Takemoto D，Hosaka K. Phytophthora infestans：a review of past and current studies on potato late blight[J]. Journal of General Plant Pathology，2014，80（1）：24-37.

[2]Nowicki M，F(xiàn)oolad M R，Nowakowska M，et al. Potato and tomato late blight caused by Phytophthora infestans：an overview of pathology and resistance breeding[J]. Plant Disease，2012，96（1）：4-17.

[3]Clement J A J，Magalon H，Glais I，et al. To be or not to be solitary：Phytophthora infestans dilemma for optimizing its reproductive fitness in multiple infections[J]. PLoS One，2012，7（6）：e37838.

[4]van Baalen M，Sabelis W. M. The dynamics of multiple infection and the evolution of virulence[J]. American Naturalist，1995，146（6）：881-910.

[5]Brown S P，Hochberg M E，Grenfell B T. Does multiple infection select for raised virulence？[J]. Trends in Microbiology，2002，10（9）：401-405.

[6]Frank S A. Models of parasite virulence[J]. Quarterly Review of Biology，1996，71（1）：37-78.

[7]Davies C M，F(xiàn)airbrother E，Webster J P. Mixed strain schistosome infections of snails and the evolution of parasite virulence[J]. Parasitology，2002，124（1）：31-38.

[8]Staves P A，Knell R J.. Virulence and competitiveness：testing the relationship during inter-and intraspecific mixed infections[J]. Evolution，2010，64（9）：2643-2652.

[9]冷偉鋒，楊 雪，劉 琦，等. 基于ASSESS圖像處理軟件的植物病害評(píng)估[J]. 中國植保導(dǎo)刊，2014，34（2）：10-12.

[10]張書建，何月秋. 介紹一種簡單的真菌單孢子分離法[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，18（3）：315-316.

[11]袁軍海，姚裕琪. 馬鈴薯晚疫病菌單孢分離技術(shù)的改進(jìn)[J]. 植物保護(hù)，2002，28（2）：58-58.

[12]Caten E C，Jinks J L. Spontaneous variability of single isolates of Phytophthora infestans. Ⅰ. Cultural variation[J]. Canadian Journal of Botany，1968，46（4）：329-348.

[13]Latijnhouwers M，Munnik T，Govers F. Phospholipase D in Phytophthora infestans and its role in zoospore encystment[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2002，15（9）：939-946.

[14]Grenville-Briggs L J，Anderson V L，F(xiàn)ugelstad J，et al. Cellulose synthesis in Phytophthora infestans is required for normal appressorium formation and successful infection of potato[J]. Plant Cell，2008，20（3）：720-738.

[15]Ben-Ami F，Mouton L，Ebert D. The effects of multiple infections on the expression and evolution of virulence in a Daphnia-endoparasite system[J]. Evolution，2008，62（7）：1700-1711.

[16]楊志輝，朱杰華，郭 強(qiáng)，等. 馬鈴薯晚疫病菌單孢分離物生物學(xué)特性的初步研究[J]. 菌物系統(tǒng)，2003，22（1）：148-152.

[17]Bohl W H，Hamm P B，Nolte P，et al. Managing late blight on irrigated potatoes in the Pacific Northwest[M]. University of Idaho Cooperative Extension System，2003. 胡彥江，張茹琴. 光照對(duì)花生網(wǎng)斑病菌生長、產(chǎn)孢及致病力的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（4）：174-176 .