李麗敏，程益清，楊盈盈，毛秀紅，季申（上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203）

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一測(cè)多評(píng)法測(cè)定保健食品中6種大豆異黃酮類成分

李麗敏，程益清，楊盈盈，毛秀紅，季申
（上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海201203）

摘要：建立一測(cè)多評(píng)方法實(shí)現(xiàn)只用一個(gè)對(duì)照品同時(shí)測(cè)定保健食品中6種大豆異黃酮類成分的含量，以解決含大豆異黃酮類成分保健食品對(duì)照品昂貴不易獲得的難題。樣品經(jīng)甲醇超聲波輔助提取后，采用Waters XbridgeC18（150 mm× 4.6 mm，3.5μm）色譜柱，以2%乙酸和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，260nm并輔以DAD紫外檢測(cè)器檢測(cè)。通過(guò)5種待測(cè)成分與染料木苷的相對(duì)保留時(shí)間、DAD光譜及參照?qǐng)D譜完成待測(cè)成分確認(rèn)；通過(guò)研究確立其他5種待測(cè)成分與染料木苷的校正系數(shù)進(jìn)行含量測(cè)定，一定線性范圍內(nèi)得到不同濃度對(duì)照品在不同儀器、人員及色譜柱上的校正系數(shù)RSD為0.4%～3.5%；3批不同來(lái)源保健食品中6種大豆異黃酮類成分測(cè)定結(jié)果與常規(guī)外標(biāo)法所得結(jié)果結(jié)果偏差為0.3%～5.8%；所建立的一測(cè)多評(píng)方法可用以大豆異黃酮及其相關(guān)保健食品的定量分析及質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。

關(guān)鍵詞：一測(cè)多評(píng)；含量測(cè)定；高效液相色譜；大豆異黃酮；保健食品

大豆異黃酮（Soybean isoflavones，ISO）是從大豆中提取分離的一類具雌激素作用的活性成分，屬黃酮類化合物中異黃酮類成分［1-2］，具有抗癌、抑制生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧等功能，在癌癥預(yù)防、保護(hù)心血管系統(tǒng)、改善和預(yù)防婦女更年期綜合癥等方面具有獨(dú)特作用［3］，近年來(lái)在保健食品領(lǐng)域應(yīng)用較廣［4-5］。

大豆異黃酮包括染料木素、大豆黃素和黃豆黃素及其7-O-葡萄糖苷衍生物共12種［1］，用于保健食品原料的大豆異黃酮多含有大豆苷、黃豆黃素、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元、染料木素6種成分，目前保健食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測(cè)定方法高效液相色譜法》）中保健食品大豆異黃酮成分的檢測(cè)方法為高效液相色譜法測(cè)定上述6種成分［6］，但實(shí)際由于市場(chǎng)供應(yīng)的高純度標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴且不易獲得，同時(shí)測(cè)定6種成分時(shí)不僅提高檢測(cè)成本且降低檢測(cè)效率。有研究者曾采用對(duì)照品替代法測(cè)定6種大豆異黃酮類成分，但其待測(cè)成分確認(rèn)需采用質(zhì)譜方法，分析成本較高［7］?！耙粶y(cè)多評(píng)”法（quantitative analysis of multi-components by singlemarker，QAMS）是近年來(lái)中藥領(lǐng)域用于多成分質(zhì)量控制的研究思路，它運(yùn)用同系列成分間存在的內(nèi)在函數(shù)比例關(guān)系，采用單個(gè)易獲得的對(duì)照品對(duì)多個(gè)成分進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（對(duì)照品沒(méi)有或難以供應(yīng)）的同步監(jiān)控，目前已用于解決中藥質(zhì)量控制中缺乏對(duì)照品這一瓶頸問(wèn)題［8-9］。

本研究以染料木苷對(duì)照品為參照，采用高效液相色譜與二極管陣列檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)確定準(zhǔn)確的待測(cè)成分指認(rèn)參數(shù)和校正系數(shù)，建立了保健食品中大豆異黃酮類成分的一測(cè)多評(píng)測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)以一種對(duì)照品同時(shí)測(cè)定6種大豆異黃酮類成分，達(dá)到降低檢驗(yàn)成本、提高檢測(cè)效率的目的，可為含大豆異黃酮類保健食品的質(zhì)量控制提供技術(shù)方案。

1　儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：Merck公司；乙酸（分析純）：上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元和染料木素等對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院、北京百靈威科技有限公司和上海同天生化生物科技有限公司。

收集3個(gè)不同來(lái)源的市售大豆異黃酮類保健食品（見(jiàn)表1），方法學(xué)驗(yàn)證均采用樣1作為研究對(duì)象。

表1　樣品來(lái)源及批號(hào)Table 1 The source and batch of samples

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備

取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元、染料木素對(duì)照品適量，配置成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液用以方法學(xué)研究。

另取染料木苷適量，加甲醇制成每1mL含染料木苷20 μg/mL的對(duì)照品溶液，用于一測(cè)多評(píng)法含量測(cè)定。

2.2供試品溶液的制備

取供試品粉末約0.2g，精密稱定，置50mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲30 min使溶解，取出，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，作為供試品溶液。

2.3色譜條件與分析方法

色譜柱：Waters XbridgeC18色譜柱（150mm×4.6mm，3.5 μm，沃特世科技有限公司），柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；以乙腈為流動(dòng)相A，2%乙酸為流動(dòng)相B，按表2進(jìn)行梯度洗脫；分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 μL進(jìn)樣分析。在此條件下，不同來(lái)源樣品中6種待測(cè)成分分離以及其與樣品中其他雜質(zhì)峰分離符合要求，見(jiàn)圖1。

表2　流動(dòng)相梯度洗脫表Table 2 The list of mobile phase gradient elution

圖1　保健食品中大豆異黃酮類分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ISO in health food

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察

分別吸取6種大豆異黃酮對(duì)照品混合溶液，配置系列濃度，按照既定方法進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)，含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，在給定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，見(jiàn)表3。

表3　大豆異黃酮類成分線性關(guān)系及范圍Table 3 Regressive equation and liner of six ISOs

2.4.2重復(fù)性試驗(yàn)

取樣1內(nèi)容物粉末0.2 g，一式6份，按照2.2項(xiàng)，分析平行操作6份樣品中各待測(cè)成分含量及其RSD，考察方法重復(fù)性。結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。

2.4.3供試品溶液的穩(wěn)定性

取制備好的供試品溶液，分別于不同時(shí)間進(jìn)樣，比較一定放置時(shí)間內(nèi)各成分分面積變化，考察供試品溶液的穩(wěn)定性，結(jié)果表明測(cè)定24 h內(nèi)6種大豆異黃酮類成分峰面積RSD小于1%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取樣1粉末0.1 g，精密稱定，一式9份，置50 mL量瓶中，分別按照樣品中含有的大豆異黃酮類成分的80%、100%、120%精密加入混合對(duì)照品，作為低、中、高3種濃度加樣回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度點(diǎn)各3份，按照

2.2項(xiàng)下分析，進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的準(zhǔn)確度試驗(yàn)，結(jié)果表明見(jiàn)表4。

表4　方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果Table 4 The result of method validation

供試品中6種待測(cè)成分的加樣回收率均在95%～105%之間，方法準(zhǔn)確可靠。

2.4.5檢測(cè)限與定量限

取經(jīng)一定比例稀釋后混合對(duì)照品，進(jìn)樣，計(jì)算各色譜峰信噪比，以3倍和10信噪比時(shí)分別作為最低檢測(cè)限和最低定量限；再按照供試品含量計(jì)算公式分別計(jì)算得出方法最低檢出限及方法最低定量限（定容體積50 mL，稱樣量0.2 g），結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.6中間精密度

采用不同儀器、不同色譜柱，由不同人員按照擬訂的方法進(jìn)行試驗(yàn)，考察方法的中間精密度，評(píng)價(jià)方法耐用性，結(jié)果表明，既定條件下，方法耐用性較好。2.4.7一測(cè)多評(píng)方法研究

染料木苷對(duì)照品易獲得，且其出峰時(shí)間適中，故以染料木苷作為參照峰，以相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行其他色譜峰確認(rèn)，通過(guò)確定待測(cè)成分與染料木苷的校正系數(shù)，計(jì)算待測(cè)成分含量。

2.4.7.1相對(duì)保留時(shí)間及待測(cè)成分確認(rèn)研究

采用不同液相色譜及不同品牌色譜柱考察6種待測(cè)成分保留時(shí)間，以染料木苷為參照計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果Table 5 The result of relative retention time

待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間較穩(wěn)定，RSD均小于5%，以不同條件得到的平均相對(duì)保留時(shí)間，并設(shè)定10%的偏差范圍，可作為待測(cè)成分確認(rèn)指標(biāo)。

2.4.7.2校正系數(shù)的確定

分別由兩位分析人員對(duì)收集到的2個(gè)不同來(lái)源的6種大豆異黃酮對(duì)照品按照低、中、高濃度范圍的配置4組標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（每組n=6）；分別在不同儀器、不同色譜柱等條件下分析，得出各待測(cè)成分校正因子，計(jì)算其與染料木苷的校正系數(shù)。最終得到108個(gè)數(shù)據(jù)，采用依拉格法進(jìn)行可疑值的剔除，計(jì)算平均值（X）及樣本總體標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），以X±3SD為可信范圍，超出即為可疑值，予以剔除，結(jié)果表明108個(gè)數(shù)據(jù)中無(wú)可疑值，說(shuō)明分析中得到的校正系數(shù)誤差較小，最終以平均值作為一測(cè)多評(píng)方法含量計(jì)算校正系數(shù)，見(jiàn)表6。

表6　校正系數(shù)測(cè)定結(jié)果Table 6 The result of the correction coefficient

2.4.7.3一測(cè)多評(píng)方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證

3批樣品中按照確定的校正系數(shù)計(jì)算6種大豆異黃酮含量，并與常規(guī)對(duì)照品法進(jìn)行比較，驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)校正系數(shù)準(zhǔn)確性，結(jié)果表明一測(cè)多評(píng)計(jì)算結(jié)果與對(duì)照品法接近，偏差小于6%，見(jiàn)表7。

表7　一測(cè)多評(píng)法與常規(guī)對(duì)照品法結(jié)果比較Table 7 Comparison of contents of ISO in health foods by two methods

3　討論

3.1一測(cè)多評(píng)方法研究的影響因素

一測(cè)多評(píng)方法應(yīng)用時(shí)通過(guò)與參照物的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行待測(cè)成分指認(rèn)，保留時(shí)間受色譜柱、儀器等因素影響較大，因此建立方法時(shí)應(yīng)全面考察影響因素，并對(duì)保證方法耐用性的參數(shù)進(jìn)行明確［10］。

3.1.1相對(duì)保留時(shí)間及準(zhǔn)確待測(cè)成分指認(rèn)

考察了不同色譜柱及儀器，結(jié)果表明必需明確規(guī)定色譜柱填料、粒度、長(zhǎng)度、粒徑等參數(shù)，才能保證既定條件下相對(duì)保留時(shí)間在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定；研究中發(fā)現(xiàn)大豆苷與大豆黃苷、大豆素與大豆黃素的相對(duì)保留時(shí)間范圍交叉覆蓋，僅相對(duì)保留時(shí)間指標(biāo)難以精確指認(rèn)待測(cè)峰，因此需給出方法參照?qǐng)D譜，以便給分析人員明確待測(cè)成分色譜峰出峰順序及其與雜質(zhì)峰分離情況，同時(shí)結(jié)合DAD光譜圖信息在245 nm～265 nm具有最大吸收峰的條件設(shè)置，可準(zhǔn)確確定待測(cè)成分。

3.2校正系數(shù)

待測(cè)成分校正系數(shù)需要大量全面的數(shù)據(jù)考察，對(duì)照品來(lái)源、純度、不同濃度、人員配置偏差等可能會(huì)帶來(lái)的誤差均會(huì)影響最終結(jié)果，進(jìn)而影響方法準(zhǔn)確性，同時(shí)儀器、色譜柱等因素也可能帶來(lái)一定偏差，因此研究中全面考慮各種因素可能帶來(lái)的誤差，考察了不同來(lái)源、不同濃度、不同人員、不同儀器和不同色譜柱的校正系數(shù)，得到較為全面的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確保方法耐用性和準(zhǔn)確性。

3.2一測(cè)多評(píng)方法應(yīng)用的實(shí)際意義

目前有關(guān)大豆異黃酮含量測(cè)定共均采用對(duì)照品外標(biāo)法測(cè)定測(cè)定6種大豆異黃酮類成分［6，11］，但大多數(shù)保健食品企業(yè)由于對(duì)照品昂貴、不易獲得，在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中僅設(shè)定其中1種成分限量，個(gè)別企業(yè)最多也僅設(shè)定大豆苷、大豆素，染料木苷和染料木素4種成分；大豆異黃酮成分不同致使性質(zhì)有所差異，進(jìn)而其在體內(nèi)作用也會(huì)有所不同［12］，對(duì)照的不易獲得制約了產(chǎn)品質(zhì)量控制設(shè)定合理質(zhì)控指標(biāo)，一測(cè)多評(píng)方法的建立可為各生產(chǎn)企業(yè)在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定大豆異黃酮類成分的含量限度提供方法依據(jù)，利于甄別產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣和進(jìn)行質(zhì)量控制。

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A Quantitative Method Using One Marker for Simultaneous Assay of Soybean Isoflavones in Health Food

LI Li-min，CHENG Yi-qing，YANG Ying-ying，MAO Xiu-hong，JI Shen
（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract：A quantitative analysis method of multi-components with single marker（QAMS）was established and validated to simultaneously determine six Soybean isoflavones（ISO）in health foods，which can solve the dilemma of natural chemical reference substances are expensive and unavailable. The samples were ultrasonicassisted extracted with methanol，the column was Waters XbridgeC18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），using 2% acetic acid and acetonitrile as the mobile phase with gradient elution，260 nm and with DAD detection was used. The component to be measured were confirmed by DAD spectrum，reference chromatogram and the relative retention time of genistin. The relative correction factors（RCF）of the other five soybean isoflavones were determined within the linear ranges，the RCF had a good reproducibility in various instruments，chromatographic columns（RSD = 0.4%-3.5%）. According to their RCF，six ISO in health food could be quantified.The results of QAMS method were validated by comparing with that of external standard method by quantified three different sources of health food，and the relative average deviation of the two method were 0.3%-5.8%. The method can be used for the quantitative analysis and quality evalution for ISOs and its related health food.

Key words：quantitative analysis method of multi-components with single marker（QAMS）；assay；HPLC；soybean isoflavones（ISO）；health food

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.040

作者簡(jiǎn)介：李麗敏（1975—），女（漢），副主任藥師，碩士，主要從事中藥及保健食品檢測(cè)方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

收稿日期：2015-03-10