李書征

十全大補(bǔ)湯對小鼠原發(fā)性肝癌的生長及血管生成的影響

李書征

目的 研究十全大補(bǔ)湯對小鼠原發(fā)性肝癌生長以及其血管生成的影響。方法 通過小鼠肝癌細(xì)胞CT-26接種小鼠，構(gòu)建荷蘭裸鼠原發(fā)性肝腫瘤模型，隨機(jī)分為對照組和研究組，其中對照組給予生理鹽水治療，研究組給予十全大補(bǔ)湯治療。治療10 d后取小鼠血液分析其中小鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子、血管抑素和內(nèi)皮抑素水平，并測量2組小鼠的腫瘤大小和質(zhì)量，免疫組織化檢測轉(zhuǎn)移瘤微血管密度及細(xì)胞增殖。結(jié)果 與對照組相比，研究組小鼠血清中血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)降低（P＜0.05），血管抑素和內(nèi)皮抑素表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），腫瘤組織Ki 67明顯降低（P＜0.05），轉(zhuǎn)移瘤微血管密度明顯降低（P＜0.05），并且研究組小鼠的腫瘤質(zhì)量和尺寸均小于對照組（P＜0.05）。結(jié)論 十全大補(bǔ)湯能夠抑制小鼠原發(fā)性肝癌腫瘤的生長，擾亂小鼠血清內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子、血管抑素和內(nèi)皮抑素的表達(dá)水平，抑制腫瘤血管的生成，對原發(fā)性肝癌小鼠的治療具有一定的臨床價(jià)值。

十全大補(bǔ)湯；肝癌；血管；生長

十全大補(bǔ)湯主要有四君子湯和四物湯，加上黃芪和肉桂組成的一劑具有補(bǔ)氣補(bǔ)血等功效的中藥。臨床研究表明[1]，對于食物不足、貧血患者具有很好的療效。此外，也有學(xué)者在研究腫瘤治療時(shí)發(fā)現(xiàn)，十全大補(bǔ)湯對于腫瘤的生長和血管的生成具有抑制作用[2]。本文建立原發(fā)性小鼠腫瘤模型，研究十全大補(bǔ)湯對小鼠原發(fā)性肝癌生長以及其血管生成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 4～6周齡小鼠，國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，SPF級，許可證號：SCXK(京)2009-0017；CT-26小鼠肝癌細(xì)胞株，購買于中科院上海細(xì)胞庫；十全大補(bǔ)湯藥物：人參6 g、肉桂3 g、黃芪12 g、白術(shù)9 g、熟地黃12 g、白芍9 g、當(dāng)歸9 g以及炙甘草3 g，購買于本地某醫(yī)院；1640培養(yǎng)基，購買于Gibco公司；青霉素和鏈霉素，購買于Solarbio公司；胎牛血清，購買于Gibco；小鼠血管內(nèi)皮生長因子、內(nèi)皮抑素和血管抑素檢測試劑盒，購買于OXOID公司，TUNEL和MVD檢測試劑盒，購買于GiBcoBRL公司；Ki 67單克隆抗體、羊抗鼠酶標(biāo)抗體和TMB顯色液，購買于天津三箭生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將小鼠肝癌細(xì)胞CT-26從液氮中去除37℃快速融化復(fù)蘇細(xì)胞，將細(xì)胞加入到15 mL的離心管中，加入5 mL 1640培養(yǎng)基，1 000 rpm/min，離心10 min，將培養(yǎng)基棄去，加入5 mL含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，至于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)待用（5%二氧化碳,37℃）。

1.2.2 小鼠肝癌腫瘤模型建立 復(fù)蘇并培養(yǎng)小鼠原發(fā)性肝癌細(xì)胞CT-26，將其培養(yǎng)到對數(shù)期，使用PBS工作液將其制備成單細(xì)胞懸浮液，采用臺盼藍(lán)染色液對其進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/mL，取0.2 mL，注射到小鼠左腋下，讓其自然生長，待腫瘤體積達(dá)到約為500 mm3時(shí)即建立成功小鼠肝癌腫瘤模型，隨機(jī)分為2組，每組10只小鼠，雌雄各半。

1.2.3 治療方法 對照組小鼠治療。配置生理鹽水，采用0.22微米的過濾器過濾配置好的生理鹽水，每天將0.4 mL的生理鹽水通過灌胃的方式給予對照組小鼠，共計(jì)10 d。

研究組小鼠通過十全大補(bǔ)湯進(jìn)行治療。將十全大補(bǔ)湯方劑中的所有藥物進(jìn)行水洗，注意肉桂放在最后，其他藥材用清水浸泡30 min，然后用水煎煮1.5 h，共煎煮2次，將2次煎煮的藥液過濾后合并在一起，然后繼續(xù)煎煮濃縮成2 mL的藥物混合液，采用0.22微米的過濾器過濾，通過蒸餾水進(jìn)行稀釋，配置成10 mg/mL的治療用藥，放置在4攝氏度的冰箱中保存，用時(shí)取出，每天將0.4 mL的治療用藥通過灌胃的方式給予研究組小鼠，共計(jì)10 d。

1.2.4 檢測方法 腫瘤體積檢測：在給藥的第2、4、6、8和第10天，測量2組小鼠內(nèi)的腫瘤體積，具體測量方法為卡鉗法測定。

血清中血管內(nèi)皮生長因子、血管抑素和內(nèi)皮抑素水平的檢測：首先，在小鼠給藥的第11天，左手拇指、食指和中指抓取小鼠的頸部頭皮，小指和無名指固定尾巴，輕壓需要摘取的眼部皮膚，使眼球充血突出，使用手術(shù)剪剪去小鼠的胡須，防止血從胡須處留下引起溶血，用鑷子夾取眼球并快速摘取，并使血液從眼眶內(nèi)流入EP管中。將取得的小鼠血液，通過離心機(jī)離心取上層血清，按試劑盒要求進(jìn)行血清中血管內(nèi)皮生長因子、血管抑素和內(nèi)皮抑素水平的檢測。

微血管密度及細(xì)胞增殖：通過酶聯(lián)免疫法，利用Ki 67單克隆抗體進(jìn)行檢測，Ki 67單克隆抗體按1∶500進(jìn)行稀釋成工作濃度，二抗采用羊抗鼠酶標(biāo)抗體1∶500進(jìn)行稀釋。Weidner法檢測微血管密度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 記錄2組患者治療前后各指標(biāo)變化情況，通過軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠腫瘤生長的對比 2組小鼠在接種CT-26細(xì)胞第6天到第10天內(nèi)全部成瘤，組內(nèi)腫瘤體積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在接種細(xì)胞的第11天將小鼠處死，取出腫瘤，測定其體積，發(fā)現(xiàn)采用十全大補(bǔ)湯進(jìn)行治療的小鼠腫瘤體積明顯小于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 2組小鼠腫瘤生長對比

2.2 2組小鼠血管生成比較 2組小鼠通過10 d的治療后，研究組血清中的生長因子內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平要比對照組低（P＜0.05），抑制因子血管抑素和內(nèi)皮抑素要比對照組高（P＜0.05），說明通過十全大補(bǔ)湯的治療能夠抑制原發(fā)肝癌小鼠腫瘤血管的生成。同時(shí)，轉(zhuǎn)移瘤微血管密度及細(xì)胞增殖檢測結(jié)果為研究組細(xì)胞核Ki 67的表達(dá)水平要比對照組低（P＜0.05）。見表2。

表2 2組小鼠血管生成對比（x±s）

3 討論

“十全大補(bǔ)湯”選鮮料加入十味中藥，五味小料，五味調(diào)料，細(xì)火燉制而成，既是一道咸鮮味濃的湯菜，又是一款藥膳，富有營養(yǎng)，滋補(bǔ)身體，久食對冠心病、高血壓、糖尿病、貧血、氣喘、面黃體弱者有一定的療效[3-4]。血管生成抑制因子可以以多種因子為靶標(biāo)抑制血管的形成。這些因子包括：MMP、各種生長因子或者生長因子受體、內(nèi)皮細(xì)胞等[5]。而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長因子（heparin-binding growth factor），可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生[6]。

國內(nèi)外研究表明，在小鼠體內(nèi)，有很多因素影響小鼠腫瘤血管的生成[7]，其中促進(jìn)血管生長的生長因子和抑制因子的調(diào)解作用影響最為重大[8]，本文研究測定小鼠血清中的血管內(nèi)生長因子和抑制因子血管抑素以及內(nèi)皮抑素的含量，發(fā)現(xiàn)研究組小鼠的促血管生成因子表達(dá)降低，抑制因子表達(dá)下降，這與前人的額研究結(jié)果相一致[9]，說明十全大補(bǔ)湯能夠有效抑制原發(fā)性肝癌腫瘤血管的生成。Ki-67是一種核蛋白，與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，其失活將會(huì)導(dǎo)致核糖體RNA合成受限[10]。此外，Ki-67在細(xì)胞增殖的各期（G 1，S，G 2和M）中均有表達(dá)，但在細(xì)胞靜止期G 0期不表達(dá)。相關(guān)研究表明，Ki 67在診斷腫瘤細(xì)胞增殖活性的研究中具有十分重要的意義[11]。本文通過測定Ki 67評價(jià)十全大補(bǔ)湯的藥物治療療效，結(jié)果表明十全大補(bǔ)湯可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜述所述，十全大補(bǔ)湯能夠抑制小鼠原發(fā)性肝癌腫瘤的生長，擾亂小鼠血清內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子、血管抑素和內(nèi)皮抑素的表達(dá)水平，抑制腫瘤血管的生成，對原發(fā)性肝癌小鼠的治療具有一定的臨床價(jià)值。

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Objective To study the influences of growth and angiogenesis of mouse primary liver cance with Shiquandabutang. Methods The mouse hepatoma cells CT-26 vaccinated mice, primary liver tumors in nude mice construct Netherlands were randomly divided into control and study groups, including control group

saline treatment group received treatment Shiquandabutang. 10 d after treatment, taking blood analysis in mice in which the mouse serum vascular endothelial growth factor, angiostatin and endostatin levels and measuring two groups of mice and tumor size, quality, immunohistochemical detection of metastatic tumor microvessel density and cell proliferation. Results Compared with the salinetreated control group, the treatment given Shiquandabutang research group of mice, the expression of vascular endothelial growth factor in serumreduced (P＜0.05), angiostatin and endostatin upregulated (P＜0.05), tumor Ki 67 was significantly lower (P＜0.05), metastatic tumor microvessel density was significantly lower (P＜0.05), and the tumor mass and size of the study group were less than the control group of mice (P＜0.05). Conclusion Shiquandabutang can inhibit tumor growth in mice with primary liver cancer, within disrupt serum levels of vascular endothelial growth factor, angiostatin and endostatin inhibit tumor angiogenesis, primary liver cancer treatment of mice with a certain clinical value.

Shiquandabutang; Liver cancer; Vascular; Growth

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.25.002

河南 453400 河南省新鄉(xiāng)市長垣縣中醫(yī)院門診西藥房 （李書征）