盧玉振， 李 祥， 周 磊(江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江蘇 淮安 223002)

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靈芝多糖的抑瘤作用及對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究?

盧玉振， 李 祥， 周 磊
(江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江蘇 淮安 223002)

摘 要:目的:探究分析靈芝多糖的抑制作用及其對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響。方法:隨機(jī)選取95只小鼠并采用瘤細(xì)胞建立免疫抑制動(dòng)物模型，將所選小鼠隨機(jī)分為48例實(shí)驗(yàn)組和47例對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠采用靈芝多糖口服液灌注，對(duì)照組小鼠給予生理鹽水灌注，觀察并分析靈芝多糖對(duì)小鼠的存活期、抑瘤作用及免疫系統(tǒng)的影響作用。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組腫瘤小鼠的生存期明顯高于對(duì)照組腫瘤小鼠(P＜0.05)，并且實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TNF-α、IL-2水平顯著提高，其腫瘤細(xì)胞NK活性及淋巴細(xì)胞增生率也顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論:靈芝多糖對(duì)小鼠腫瘤無(wú)直接抑制作用，其抗腫瘤功效主要是通過(guò)機(jī)體的免疫系統(tǒng)介導(dǎo)，并且靈芝多糖能夠有效延長(zhǎng)機(jī)體生存期。

關(guān)鍵詞:靈芝多糖； 抑瘤作用； 免疫系統(tǒng)； 小鼠腫瘤

靈芝是我國(guó)中醫(yī)學(xué)上的傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，屬于靈芝屬真菌，包括紫芝、白芝、赤芝、薄樹芝等多種品種，其中以赤芝最為常見[1]。靈芝具有扶正固本、延年益壽、滋補(bǔ)強(qiáng)體等功效，主要活性成分包含三萜類、生物堿、多糖等，其中靈芝多糖是臨床研究中發(fā)現(xiàn)的主要活性成分之一[2]。多項(xiàng)臨床研究表明，靈芝多糖具有較好的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用[3，4]。本研究通過(guò)建立實(shí)體移植瘤小鼠模型，進(jìn)一步探究了靈芝多糖對(duì)小鼠腫瘤的抑制作用及其調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)報(bào)告如下:

1　材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑:健康小鼠95只，鼠齡5～8周，體重16～24g，雌性小鼠47例，雄性小鼠48例。靈芝多糖從實(shí)驗(yàn)室研究用的靈芝菌絲體發(fā)酵液中提??；小鼠腫瘤細(xì)胞由微生物實(shí)驗(yàn)室提供；F1uka產(chǎn)PCH100電腦二氧化碳孵育培養(yǎng)箱，TNF-α、IL-2試劑盒由上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，MTT、ConA，酶標(biāo)儀由奧地利進(jìn)口儀器。

1.2方 法

1.2.1腫瘤小鼠模型建立:由小鼠腫瘤菌株進(jìn)行腹腔傳代接種，按細(xì)胞數(shù)1×106/ mL，每只接種肉瘤細(xì)胞0. 2mL，小鼠腹腔注射，所選小鼠均按照常規(guī)方式進(jìn)行飼養(yǎng)，24h后進(jìn)行隨機(jī)分組。

1.2.2生存期觀察:實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射靈芝多糖，每天注射量1.0mg/ mL，連續(xù)腹腔注射一周；對(duì)照組小鼠按照同樣方法、同等注射量注射無(wú)菌生理鹽水，分別觀察兩組小鼠的生存期。

1.2.3免疫功能檢測(cè):兩組小鼠在接種腫瘤細(xì)胞后第10天，分別取小鼠的眼球血，并離心血清處理，留取離心血備用，然后取小鼠脾進(jìn)行免疫功能檢測(cè)試驗(yàn)。①NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè):首先，將所取小鼠脾部在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行處理，分別制成單個(gè)細(xì)胞，并采用無(wú)菌水進(jìn)行紅細(xì)胞休克處理30s左右，并迅速加入等量的1.7%生理鹽水進(jìn)行等滲恢復(fù)；其次，采用錐蟲藍(lán)拒染計(jì)數(shù)活細(xì)胞，待活細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到95%以上既可以將其與YAC -1一起放置于培養(yǎng)板上進(jìn)行MTT法檢測(cè)小鼠的NK細(xì)胞活性。最后，采用96孔培養(yǎng)板用于檢測(cè)細(xì)胞活性，各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，其中NK細(xì)胞活性的檢測(cè)方式以靶細(xì)胞對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值和效應(yīng)細(xì)胞孔A值，并除以靶細(xì)胞對(duì)照孔A值[5]。②淋巴細(xì)胞增生率的檢測(cè)方式:將濃度為5×106/ mL的脾細(xì)胞加入培養(yǎng)孔中，每孔200uL左右，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的處理方式不同，實(shí)驗(yàn)組在每孔各加50uL/ mL的ConA20uL，對(duì)照組在每個(gè)培養(yǎng)孔中加入20uL培養(yǎng)液，并放置于37℃的二氧化碳孵育培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。最后，離心培養(yǎng)液，并取100uL的上清液，采用MTT進(jìn)行A值測(cè)定，并計(jì)算小鼠淋巴細(xì)胞的增生率，淋巴細(xì)胞的增生率以實(shí)驗(yàn)孔A值-對(duì)照孔A值再除以對(duì)照組孔A值進(jìn)行測(cè)定[6]。③血清TNF-α水平測(cè)定:采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法及TNF-α試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定A值繪制曲線，并從校正曲線上進(jìn)行檢測(cè)待檢標(biāo)本中TNF-α的水平。④血清IL-2測(cè)定:與血清TNF-α水平測(cè)定方式相同，在在酶聯(lián)免疫檢測(cè)法的基礎(chǔ)上，采用IL -2ELISA試劑盒測(cè)定，并從校正A曲線上進(jìn)行IL-2水平的檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組小鼠的平均存活期、及血清中TNF-α、IL -2含量等指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果采用±s來(lái)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t或t'檢驗(yàn)，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié) 果

2.1兩組小鼠的生存期比較:兩組小鼠在接種腫瘤細(xì)胞后，其生存期表現(xiàn)出不同差異，其中實(shí)驗(yàn)組小鼠的存活期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，其平均存活期(44.2±12.7)d也顯著多于對(duì)照組(27.7±10.5)d，兩組對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1　兩組腫瘤小鼠的存活期差異比較(±s，d)

表1　兩組腫瘤小鼠的存活期差異比較(±s，d)

組別　例數(shù)　存活期　平均存活期對(duì)照組　47　10～56　27.7±10.5實(shí)驗(yàn)組　48　18～64　44.2±12.7

表2　兩組小鼠TNF-α、IL-2水平的差異比較(±s，umoL/ L)

表2　兩組小鼠TNF-α、IL-2水平的差異比較(±s，umoL/ L)

組別　例數(shù)　TNF-α　IL-2對(duì)照組　47　137.74±128.19 285.41±39.74實(shí)驗(yàn)組　48　225.06±87.36　401.53±77.93 t -18.83　22.09 P -0.17　0.01

表3　兩組小鼠的腫瘤NK細(xì)胞活性及淋巴細(xì)胞增生差異比較(±s，%)

表3　兩組小鼠的腫瘤NK細(xì)胞活性及淋巴細(xì)胞增生差異比較(±s，%)

組別　例數(shù)　NK活性　淋巴細(xì)胞增生對(duì)照組　47　51.32±8.74　55.29±7.42實(shí)驗(yàn)組　48　70.61±9.38　65.17±9.24 t -12.85　20.46 P -0.027　0.014

2.2兩組小鼠血清TNF-α、IL-2含量比較:實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TNF-α(225.06±87.36)pg/ mL、IL-2水平(401.53±77.93)umoL/ L明顯高于對(duì)照組，兩組對(duì)比差異顯著(P＜0.05)。見表2。

2.3兩組小鼠的免疫指標(biāo)比較:兩組小鼠在分別經(jīng)過(guò)靈芝多糖和生理鹽水灌注后，其腫瘤NK細(xì)胞表現(xiàn)出不同的生理活性，淋巴細(xì)胞增生率也出現(xiàn)明顯不同，兩組對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

3　討 論

靈芝在我國(guó)中草藥應(yīng)用上具有兩千多年的歷史，能夠有效提高機(jī)體的非特異和特異免疫功能，臨床研究顯示，靈芝多糖能夠明顯抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，能夠促進(jìn)機(jī)體免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生。腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病之一，具有較高的死亡率，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成了巨大影響。近年來(lái)，臨床上對(duì)抗腫瘤的藥物研究逐漸延伸到了從真菌及其代謝產(chǎn)物中進(jìn)行有效活性成分的提取，靈芝作為我國(guó)傳統(tǒng)應(yīng)用的重要中草藥之一，其中的靈芝多糖成分是靈芝的有效活性成分，通過(guò)提取靈芝菌絲體發(fā)酵液中的靈芝多糖，能夠深入探究分析靈芝多糖對(duì)腫瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)臨床研究顯示，TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子可以激活NK細(xì)胞，NK細(xì)胞在機(jī)體的腫瘤監(jiān)視和防護(hù)中起著非常重要的作用，活化的NK細(xì)胞可以釋放IFN-r、TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的作用，增強(qiáng)抗腫瘤效果。此外，靈芝多糖具有有效促進(jìn)腫瘤小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)ConA的增殖反應(yīng)，說(shuō)明靈芝多糖具有增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫作用的功效。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用靈芝多糖灌注的實(shí)驗(yàn)組小鼠其血清IL-2水平明顯高于采用生理鹽水灌注的對(duì)照組，說(shuō)明靈芝多糖能夠提高腫瘤小鼠血清中的IL-2含量，從而有效提高腫瘤小鼠的免疫功能。

參考文獻(xiàn):

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Tumor Suppression Function and the Effect of Ganoderma Lucidum Polysaccharide on the Immune System of Mice

LU Yuzhen， LI Xiang， ZHOU Lei
(The Second People's Hospital of Huaian，Jiangsu Huaian 223002，China)

Abstract:Objective:To exp1ore the inhibition of ganoderma po1ysaccharides and its effects on the immune system of mice. Method: 95 mice were random1y se1ected and estab1ished the anima1 mode1 of immunosuppression by tumor ce11，then random1y divided into experimenta1 group (48 cases) and contro1 group (47 cases). The mice in the experimenta1 group were given ganoderma 1ucidum po1ysaccharide by ora1 1iquid infusion，whi1e the mice in the contro1 group were given sa1ine infusion，then the in1uemce of ganoderma 1ucidum po1ysaccharides on mice surviva1 time，tumor suppression effect and the immune system were observed and ana1yzed. Result: The surviva1 period of the experimenta1 mice in the experimenta1 group was obvious1y higher than that of the contro1 group (P＜0.05)，and serum TNF a1pha，IL - 2 1eve1s of mice in the experimenta1 group increased significant1y，the tumor ce11s，NK activity and 1ymphocyte pro1iferation rate was a1so significant1y higher than that of contro1 group (P＜0.05). Conclusion: Ganoderma 1ucidum po1ysaccharide has no direct inhibitory effect on tumor in mice and its anti-tumor effect is main1y mediated by the immune system，and ganoderma 1ucidum po1ysaccharides can effective1y pro1ong thesurviva1. time.

Key words:Ganoderma 1ucidum po1ysaccharide； Tumor suppression effect； The immune system；Tumors in mice

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.02.005

文章編號(hào):1006-6233(2016)02-0190-03

基金項(xiàng)目：?江蘇省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目，(編號(hào)：H201346)