盧玉振， 李 祥， 周 磊(江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院檢驗科， 江蘇 淮安 223002)

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靈芝多糖的抑瘤作用及對小鼠免疫系統(tǒng)影響的實驗研究?

盧玉振， 李 祥， 周 磊
(江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院檢驗科， 江蘇 淮安 223002)

摘 要:目的:探究分析靈芝多糖的抑制作用及其對小鼠免疫系統(tǒng)的影響。方法:隨機選取95只小鼠并采用瘤細胞建立免疫抑制動物模型，將所選小鼠隨機分為48例實驗組和47例對照組，實驗組小鼠采用靈芝多糖口服液灌注，對照組小鼠給予生理鹽水灌注，觀察并分析靈芝多糖對小鼠的存活期、抑瘤作用及免疫系統(tǒng)的影響作用。結果:實驗組腫瘤小鼠的生存期明顯高于對照組腫瘤小鼠(P＜0.05)，并且實驗組小鼠血清中TNF-α、IL-2水平顯著提高，其腫瘤細胞NK活性及淋巴細胞增生率也顯著高于對照組(P＜0.05)。結論:靈芝多糖對小鼠腫瘤無直接抑制作用，其抗腫瘤功效主要是通過機體的免疫系統(tǒng)介導，并且靈芝多糖能夠有效延長機體生存期。

關鍵詞:靈芝多糖； 抑瘤作用； 免疫系統(tǒng)； 小鼠腫瘤

靈芝是我國中醫(yī)學上的傳統(tǒng)補益中藥，屬于靈芝屬真菌，包括紫芝、白芝、赤芝、薄樹芝等多種品種，其中以赤芝最為常見[1]。靈芝具有扶正固本、延年益壽、滋補強體等功效，主要活性成分包含三萜類、生物堿、多糖等，其中靈芝多糖是臨床研究中發(fā)現(xiàn)的主要活性成分之一[2]。多項臨床研究表明，靈芝多糖具有較好的抗腫瘤和免疫調節(jié)作用[3，4]。本研究通過建立實體移植瘤小鼠模型，進一步探究了靈芝多糖對小鼠腫瘤的抑制作用及其調節(jié)作用?，F(xiàn)報告如下:

1　材料與方法

1.1主要實驗材料與試劑:健康小鼠95只，鼠齡5～8周，體重16～24g，雌性小鼠47例，雄性小鼠48例。靈芝多糖從實驗室研究用的靈芝菌絲體發(fā)酵液中提??；小鼠腫瘤細胞由微生物實驗室提供；F1uka產(chǎn)PCH100電腦二氧化碳孵育培養(yǎng)箱，TNF-α、IL-2試劑盒由上海森雄科技實業(yè)有限公司生產(chǎn)，MTT、ConA，酶標儀由奧地利進口儀器。

1.2方 法

1.2.1腫瘤小鼠模型建立:由小鼠腫瘤菌株進行腹腔傳代接種，按細胞數(shù)1×106/ mL，每只接種肉瘤細胞0. 2mL，小鼠腹腔注射，所選小鼠均按照常規(guī)方式進行飼養(yǎng)，24h后進行隨機分組。

1.2.2生存期觀察:實驗組小鼠腹腔注射靈芝多糖，每天注射量1.0mg/ mL，連續(xù)腹腔注射一周；對照組小鼠按照同樣方法、同等注射量注射無菌生理鹽水，分別觀察兩組小鼠的生存期。

1.2.3免疫功能檢測:兩組小鼠在接種腫瘤細胞后第10天，分別取小鼠的眼球血，并離心血清處理，留取離心血備用，然后取小鼠脾進行免疫功能檢測試驗。①NK細胞殺傷活性檢測:首先，將所取小鼠脾部在無菌環(huán)境下進行處理，分別制成單個細胞，并采用無菌水進行紅細胞休克處理30s左右，并迅速加入等量的1.7%生理鹽水進行等滲恢復；其次，采用錐蟲藍拒染計數(shù)活細胞，待活細胞計數(shù)達到95%以上既可以將其與YAC -1一起放置于培養(yǎng)板上進行MTT法檢測小鼠的NK細胞活性。最后，采用96孔培養(yǎng)板用于檢測細胞活性，各設置3個復孔，其中NK細胞活性的檢測方式以靶細胞對照孔A值-實驗孔A值和效應細胞孔A值，并除以靶細胞對照孔A值[5]。②淋巴細胞增生率的檢測方式:將濃度為5×106/ mL的脾細胞加入培養(yǎng)孔中，每孔200uL左右，實驗組和對照組的處理方式不同，實驗組在每孔各加50uL/ mL的ConA20uL，對照組在每個培養(yǎng)孔中加入20uL培養(yǎng)液，并放置于37℃的二氧化碳孵育培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。最后，離心培養(yǎng)液，并取100uL的上清液，采用MTT進行A值測定，并計算小鼠淋巴細胞的增生率，淋巴細胞的增生率以實驗孔A值-對照孔A值再除以對照組孔A值進行測定[6]。③血清TNF-α水平測定:采用酶聯(lián)免疫檢測法及TNF-α試劑盒進行檢測，根據(jù)標準測定A值繪制曲線，并從校正曲線上進行檢測待檢標本中TNF-α的水平。④血清IL-2測定:與血清TNF-α水平測定方式相同，在在酶聯(lián)免疫檢測法的基礎上，采用IL -2ELISA試劑盒測定，并從校正A曲線上進行IL-2水平的檢測。

1.3統(tǒng)計分析:采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組小鼠的平均存活期、及血清中TNF-α、IL -2含量等指標檢測結果采用±s來表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t或t'檢驗，以P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

2.1兩組小鼠的生存期比較:兩組小鼠在接種腫瘤細胞后，其生存期表現(xiàn)出不同差異，其中實驗組小鼠的存活期明顯長于對照組，其平均存活期(44.2±12.7)d也顯著多于對照組(27.7±10.5)d，兩組對比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1　兩組腫瘤小鼠的存活期差異比較(±s，d)

表1　兩組腫瘤小鼠的存活期差異比較(±s，d)

組別　例數(shù)　存活期　平均存活期對照組　47　10～56　27.7±10.5實驗組　48　18～64　44.2±12.7

表2　兩組小鼠TNF-α、IL-2水平的差異比較(±s，umoL/ L)

表2　兩組小鼠TNF-α、IL-2水平的差異比較(±s，umoL/ L)

組別　例數(shù)　TNF-α　IL-2對照組　47　137.74±128.19 285.41±39.74實驗組　48　225.06±87.36　401.53±77.93 t -18.83　22.09 P -0.17　0.01

表3　兩組小鼠的腫瘤NK細胞活性及淋巴細胞增生差異比較(±s，%)

表3　兩組小鼠的腫瘤NK細胞活性及淋巴細胞增生差異比較(±s，%)

組別　例數(shù)　NK活性　淋巴細胞增生對照組　47　51.32±8.74　55.29±7.42實驗組　48　70.61±9.38　65.17±9.24 t -12.85　20.46 P -0.027　0.014

2.2兩組小鼠血清TNF-α、IL-2含量比較:實驗組小鼠血清中TNF-α(225.06±87.36)pg/ mL、IL-2水平(401.53±77.93)umoL/ L明顯高于對照組，兩組對比差異顯著(P＜0.05)。見表2。

2.3兩組小鼠的免疫指標比較:兩組小鼠在分別經(jīng)過靈芝多糖和生理鹽水灌注后，其腫瘤NK細胞表現(xiàn)出不同的生理活性，淋巴細胞增生率也出現(xiàn)明顯不同，兩組對比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表3。

3　討 論

靈芝在我國中草藥應用上具有兩千多年的歷史，能夠有效提高機體的非特異和特異免疫功能，臨床研究顯示，靈芝多糖能夠明顯抑制小鼠腫瘤的生長，能夠促進機體免疫細胞因子的產(chǎn)生。腫瘤是嚴重危害人類生命健康的疾病之一，具有較高的死亡率，對患者的生活質量造成了巨大影響。近年來，臨床上對抗腫瘤的藥物研究逐漸延伸到了從真菌及其代謝產(chǎn)物中進行有效活性成分的提取，靈芝作為我國傳統(tǒng)應用的重要中草藥之一，其中的靈芝多糖成分是靈芝的有效活性成分，通過提取靈芝菌絲體發(fā)酵液中的靈芝多糖，能夠深入探究分析靈芝多糖對腫瘤小鼠免疫系統(tǒng)的影響。國內外多項臨床研究顯示，TNF-α、IL-2等細胞因子可以激活NK細胞，NK細胞在機體的腫瘤監(jiān)視和防護中起著非常重要的作用，活化的NK細胞可以釋放IFN-r、TNF-α、IL-2等細胞因子，調節(jié)巨噬細胞的作用，增強抗腫瘤效果。此外，靈芝多糖具有有效促進腫瘤小鼠淋巴細胞對ConA的增殖反應，說明靈芝多糖具有增強機體細胞免疫作用的功效。本研究的實驗結果顯示，采用靈芝多糖灌注的實驗組小鼠其血清IL-2水平明顯高于采用生理鹽水灌注的對照組，說明靈芝多糖能夠提高腫瘤小鼠血清中的IL-2含量，從而有效提高腫瘤小鼠的免疫功能。

參考文獻:

[1] 趙樹立，聶運中，梁桂寧，等.靈芝多糖聯(lián)合低劑量順鉑抑瘤作用及對荷瘤鼠免疫功能的影響[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2012，34(12)：1084～1087.

[2] Gao Y，Zhou S，Wen J，et a1.Mechanism of the antiu1cerogenic effect of Ganoderma 1ucidum po1ysaccharides on indomethacin-induced 1esions in the rat[J].Life Sciences，2002，72(6)：731～745.

[3] 吳先闖，杜鋼軍，郝海軍，等.玉米須多糖對H22荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用及其對小鼠免疫功能的影響[J].華西藥學雜志，2015，30(1)：26～29.

[4] 盧見行，肖傳，田華張，等.靈芝多糖GLP抑制小鼠骨肉瘤細胞S-180在體內生長的作用機制[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12(2)：262～264.

[5] 崔永偉.靈芝多糖的急性毒性和抗腫瘤作用[J].中國當代醫(yī)藥，2012，19(2)：46～47.

[6] 賈靖，孫立新，葛志華，等.B16F10黑素瘤細胞培養(yǎng)上清對同基因小鼠脾淋巴細胞增殖的抑制作用[J].河北醫(yī)學，2010，16(7)：769～771.

Tumor Suppression Function and the Effect of Ganoderma Lucidum Polysaccharide on the Immune System of Mice

LU Yuzhen， LI Xiang， ZHOU Lei
(The Second People's Hospital of Huaian，Jiangsu Huaian 223002，China)

Abstract:Objective:To exp1ore the inhibition of ganoderma po1ysaccharides and its effects on the immune system of mice. Method: 95 mice were random1y se1ected and estab1ished the anima1 mode1 of immunosuppression by tumor ce11，then random1y divided into experimenta1 group (48 cases) and contro1 group (47 cases). The mice in the experimenta1 group were given ganoderma 1ucidum po1ysaccharide by ora1 1iquid infusion，whi1e the mice in the contro1 group were given sa1ine infusion，then the in1uemce of ganoderma 1ucidum po1ysaccharides on mice surviva1 time，tumor suppression effect and the immune system were observed and ana1yzed. Result: The surviva1 period of the experimenta1 mice in the experimenta1 group was obvious1y higher than that of the contro1 group (P＜0.05)，and serum TNF a1pha，IL - 2 1eve1s of mice in the experimenta1 group increased significant1y，the tumor ce11s，NK activity and 1ymphocyte pro1iferation rate was a1so significant1y higher than that of contro1 group (P＜0.05). Conclusion: Ganoderma 1ucidum po1ysaccharide has no direct inhibitory effect on tumor in mice and its anti-tumor effect is main1y mediated by the immune system，and ganoderma 1ucidum po1ysaccharides can effective1y pro1ong thesurviva1. time.

Key words:Ganoderma 1ucidum po1ysaccharide； Tumor suppression effect； The immune system；Tumors in mice

文獻標識碼:B

doi:10.3969/ j.issn.1006-6233.2016.02.005

文章編號:1006-6233(2016)02-0190-03

基金項目：?江蘇省衛(wèi)生廳科研基金項目，(編號：H201346)