童曉鵬，袁東亞

西藏民族大學(xué)生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室(陜西 咸陽(yáng) 712082)

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克隆探針技術(shù)發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎新型抗原

童曉鵬，袁東亞

西藏民族大學(xué)生命科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室(陜西 咸陽(yáng) 712082)

【摘要】類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種病因尚未明了的全身性自身免疫性疾病。近年來(lái)，在RA的治療方面國(guó)際科研界有了較大的進(jìn)展，但目前仍然很少有新的自身抗原被發(fā)現(xiàn)。本課題首次運(yùn)用患者關(guān)節(jié)滑膜液中的抗體作為探針，提取RNA，進(jìn)行cDNA基因庫(kù)免疫篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)新型自身抗原cDNA克隆，因其與RBP1有36.5%的氨基酸序列相同，因此命名RBP1 like Protein(Rbik)，此自身抗原的發(fā)現(xiàn)有可能為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)診斷和治療提供新的可能指標(biāo)和靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；自身抗原；RBP1；克??；免疫

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎為特點(diǎn)的進(jìn)行性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鞯淖陨砻庖咝约膊?，可?dǎo)致對(duì)稱性的多關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)功能障礙，甚至終身殘疾的慢性全身性炎癥性疾病[1]。近年來(lái)，在RA的治療方面有了較大的進(jìn)展，尤其是新的藥物研制成功，極大地改善了RA的療效：①新的細(xì)胞因子拮抗劑研制成功并上市，將來(lái)有可能進(jìn)行細(xì)胞因子的聯(lián)合治療，將提高其療效，減少不良反應(yīng)，促進(jìn)免疫耐受，減少?gòu)?fù)發(fā)[2]；②非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥物，能減輕患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀并改善關(guān)節(jié)功能，但并不能阻止疾病的進(jìn)展，也不能防止關(guān)節(jié)的破壞，其對(duì)胃腸道的不良反應(yīng)限制了它的使用[3]；③糖皮質(zhì)激素在治療中的作用一直存有爭(zhēng)議，臨床實(shí)驗(yàn)證明[4]口服小劑量糖皮質(zhì)激素可顯著緩解關(guān)節(jié)癥狀，且可較快地改善患者的關(guān)節(jié)功能，但長(zhǎng)期應(yīng)用易導(dǎo)致患者對(duì)激素的依賴性，還會(huì)引起不良反應(yīng)；④生物制劑應(yīng)用于治療，是近年來(lái)的重大進(jìn)展，是實(shí)驗(yàn)研究成果應(yīng)用于臨床的典范，但是長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)引起致免疫性，伴隨著患者產(chǎn)生大量抗藥物抗體，將會(huì)使治療效果下降[5]。因此，尋找RA相關(guān)抗原、為治療提供新的指標(biāo)和靶點(diǎn)成為國(guó)際RA的研究熱點(diǎn)和新的期待。國(guó)內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)一直在做誘發(fā)此病的相關(guān)抗原的克隆實(shí)驗(yàn)，但是目前仍然很少有新的自身抗原被發(fā)現(xiàn)[6-8]。過(guò)去幾年來(lái)所報(bào)道的RA的新自身抗原有g(shù)lycoprotein-39[9]，Calpastatin[10]。軟骨組織中的自身抗原glycoprotein-39可以被RA患者的外周血T細(xì)胞識(shí)別，并與RA的慢性炎癥發(fā)展相關(guān)。Calpastatin是一種鈣蛋白酶抑制蛋白，其自身抗體較其他自身免疫病高頻率的出現(xiàn)于RA患者血清中，與RA的病因病理機(jī)制有相關(guān)性。但是這些自身抗原的cDNA庫(kù)構(gòu)建都來(lái)自于其他組織或者細(xì)胞。本研究中用患者關(guān)節(jié)滑膜液中的抗體作為探針，運(yùn)用克隆技術(shù)得到新型cDNA，并試探性分析了該新型自身抗原。

1材料與方法

1.1血清和滑膜液選擇陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)科2010年6月—2015年7月間收治RA患者67例，所有患者均符合美國(guó)類風(fēng)濕病協(xié)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，同時(shí)選擇30名健康體檢者，除使用關(guān)節(jié)穿刺術(shù)提取其中18例RA患者的滑膜液外，其他患者抽取血清。運(yùn)用Protein A(bio PROCESSING， Durham， UK)提純柱提純滑膜液IgG以便進(jìn)行cDNA基因庫(kù)的免疫篩選。

1.2從培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞中提取mRNA從18例患者滑膜切除手術(shù)中提取少量滑膜切碎，0.25% collagenase(Collagenase S-1； Nitta Gelatin， Osaka， Japan)在RPMI 1 640中消化，收集細(xì)胞(200 g ， 5 min)，培養(yǎng)7 d后，用TRIzol reagent (Gibco/BRL， Gaithersburg， MD)收集RNA。

1.3構(gòu)建cDNA基因庫(kù)從RA患者滑膜總RNA中提純poly(A)+RNA (10 μg)。使用oligo(dT)-latex beads (Oligotex-dT30；Takara Shuzo，Otsu，Japan)純化poly(A)+RNA (10 μg)。用TimeSaver cDNA synthesis kit (Pharmacia)合成cDNA。cDNA大于200 bp的產(chǎn)物被Chroma spin-400 columns (Clontech，Palo Alto，CA)選擇并使用Eco RI編譯合成。

1.4檢測(cè)cDNA基因庫(kù)以及SFIgG的提純從λExCell DNA分割出cDNA片段后電泳。使用image analyzing tools (AE-6905C)分析分布的cDNA片段。應(yīng)用Gene Checker kit (Invitrogen，San Diego，CA)使用PCR分析評(píng)估克隆cDNA種類，提純的SF IgG根據(jù)SDS-PAGE法檢測(cè)。

1.5cDNA基因庫(kù)免疫篩選基因庫(kù)篩選之前，通過(guò)immunoblotting預(yù)備實(shí)驗(yàn)從6個(gè)RA患者的滑膜細(xì)胞裂解產(chǎn)物提取SF IgG溶液，在SF IgG溶液中篩選hexamer以及Not I oligo(dT)的cDNA基因庫(kù)。使用含有3%，0.5%，0% Tween 20的PBS洗血小板轉(zhuǎn)移膜，隨后用5%脫脂奶粉PBS封閉，進(jìn)而在SF IgG溶液中4℃環(huán)境下反應(yīng)1晚。之后再次如上洗滌并與peroxidase-conjugated goat anti-human IgG(Cappel #55252；Organon Teknica，Durham，NC)在室溫下反應(yīng)1h。再次洗滌之后，使用ECL kit (Amersham，Amer-sham，UK)發(fā)現(xiàn)二抗，陽(yáng)性克隆通過(guò)反復(fù)篩選直到全部陽(yáng)性。

1.6cDNA測(cè)序和分析使用373 DNA sequencing system (Applied Biosystems)測(cè)序，并通過(guò)DNA Data Bank of Japan (DDBJ)尋找已知的相似基因。

2結(jié)果

2.1新型RA自身抗原cDNA克隆的發(fā)現(xiàn)兩個(gè)cDNA基因庫(kù)經(jīng)過(guò)hexamer以及Not I oligo(dT)篩選分別包含了50 000 and 150 000的克隆，平均長(zhǎng)度為1 kb。兩個(gè)cDNA基因庫(kù)結(jié)果顯示互補(bǔ)(圖1A，圖1B)。提純的SFIgG經(jīng)過(guò)確認(rèn)(圖1C)，一個(gè)4 405bp的新型陽(yáng)性克隆發(fā)現(xiàn)(在DDBJ/EMBL/Genbank的登錄號(hào)為AB030181)。

A： 一列和二列分別為cDNA基因庫(kù)被Eco RI和Not I分解，箭頭為平均cDNA片段長(zhǎng)度；B：Gene Checker kit (Invitrogen)的引物應(yīng)用PCR法分析cDNA基因庫(kù)；C：運(yùn)用SDS-PAGE后SFIgG探針銀染結(jié)果。圖1　cDNA基因庫(kù)以及SFIgG的提純

2.2測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)新型RA自身抗原與RBP1(Retinol binding protein 1)有36.5%的氨基酸序列相同，因此命名為RBP1類似蛋白(RBP1-like protein： Rbik)(圖2)。

圖2　Rbik與RBP1測(cè)序分析

3結(jié)論

本研究中用患者關(guān)節(jié)滑膜液中的抗體作為探針，運(yùn)用克隆技術(shù)得到新型cDNA。與RBP1有36.5%的氨基酸序列相同，因此命名為Rbik。RBP1是血液中維生素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由肝臟合成、廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中，目前研究認(rèn)為RBP1與癌癥抑制蛋白R(shí)B蛋白結(jié)合，并促進(jìn)其他相關(guān)蛋白的結(jié)合，對(duì)轉(zhuǎn)錄有一定調(diào)節(jié)功能[12]。此自身抗原的發(fā)現(xiàn)有可能為RA的實(shí)驗(yàn)診斷和治療提供新的可能指標(biāo)和靶點(diǎn)，同時(shí)由于與RBP1的氨基酸序列相似，其在細(xì)胞周期以及細(xì)胞增殖方面的功能還有待研究。

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責(zé)任編輯：艾茜

Research on a Novel Autoantigen in Rheumatoid Arthritis

Tong Xiaopeng，Yuan Dongya

(BasicLifeScienceLaboratory,XizangMinzuUniversity,Xianyang712082,China)

【Abstract】Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by long-term inflammation and resultant destruction of multiple joints. In joint spaces of patients with rheumatoid arthritis (RA), persistently presented antigens appear to play a major role in sustained inflammation by continuously stimulating T and B cells. Synovium seems to supply most of such antigens. We cloned RBP1-like protein from synovial tissue, named Rbik,as an autoantigen in RA.Rbik has 36.5% homology with retinoblastoma binding protein 1 (RBP1) which associates with retinoblastoma (RB) tumor suppressor protein and is thought to thereby modulate the gene repression activity of RB. we report that analysis between RA and the new autoantibodies to RBP1-like Protein(Rbik).

【Key words】RA;autoantigen;RBP1;cloning;immunology

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560732);西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015ZR-13-18);西藏自治區(qū)高校青年教師創(chuàng)新支持計(jì)劃項(xiàng)目(QC2015-61)。

作者簡(jiǎn)介童曉鵬(1980- )，男，陜西西安人，博士，副教授，研究方向： 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

【中圖分類號(hào)】R446.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1008-8164(2016)01-0008-03

收稿日期：2015-10-18