魏玉華，張麗萌，周雪，樊自堯，于永忠，吳志軍，孫虎男，于立權(quán)，崔玉東（.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶6339；.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

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抗停乳鏈球菌GapC1-150aa單克隆抗體的制備及生物活性

魏玉華1，張麗萌1，周雪2，樊自堯2，于永忠2，吳志軍2，孫虎男2，于立權(quán)2，崔玉東2
（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

摘要：為了深入研究停乳鏈球菌GapC蛋白的抗原性，用原核表達(dá)的GapC免疫優(yōu)勢(shì)片段—GapC1-150aa蛋白免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備獲得3株抗停乳鏈球菌GapC1-150aa蛋白不同表位的單克隆抗體1F2、1E11和5B7。經(jīng)鑒定確定，3株單抗均IgG1亞型，其輕鏈均為κ鏈，3株單克隆抗體均能與停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和乳房鏈球菌的GapC發(fā)生特異性反應(yīng)而不與其他細(xì)菌蛋白發(fā)生反應(yīng)，均具有顯著的調(diào)理活性，并且具有一定的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：停乳鏈球菌；GapC；單克隆抗體

奶牛乳房炎是公認(rèn)的對(duì)奶牛業(yè)造成慘重?fù)p失的重要疾病之一，不僅發(fā)病率比較高，且常常是反復(fù)發(fā)生，嚴(yán)重危害奶牛的健康并影響乳制品的質(zhì)量[1-3]。隨著抗生素的大量使用以及耐藥菌株的出現(xiàn)，使奶牛乳房炎防治變得尤為困難。引起奶牛乳房炎的主要病原菌為無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等，其中3種鏈球菌引起的奶牛乳房炎能夠占到發(fā)病率的30%以上。研究表明[4]，停乳鏈球菌GapC蛋白作為一種保護(hù)性抗原能夠有效地預(yù)防停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌引起的感染，具有交叉免疫保護(hù)作用，且GapC1-150aa是GapC蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)片段。但有關(guān)鏈球菌抗原檢測(cè)鑒定和GapC1-150aa免疫優(yōu)勢(shì)片段的抗原性缺乏研究。為此，研究制備和篩選了停乳鏈球菌GapC1-150aa蛋白的3株單克隆抗體，并深入研究了其生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究停乳鏈球菌GapC1-150aa蛋白的B細(xì)胞表位和建立以單抗為基礎(chǔ)的鏈球菌快速檢測(cè)及鑒別診斷方法提供依據(jù)。

1　材料和方法

1.1菌株和質(zhì)粒

E.coli DH5α、BL21（DE3）、S.dysgalactiae、S.a－galactiae和S.uberis由實(shí)驗(yàn)室提供；重組菌Rosetta （DE3）/pET-32a（+）/gapC1-150aa、Rosetta（DE3）/pET-30a （+）/trap、Rosetta（DE3）-/pET32a（+）/gapc、Rosetta （DE3）/pQE30/isdA、BL21（DE3）/pET-32a（+）/clfA、BL21（DE3）/pET-32a（+）/can、BL21（DE3）/pET-32a （+）/fnbpA、BL21（DE3）/pET30a-GapC和BL21（DE3）/pET32a-GapC由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3主要試劑

培養(yǎng)基改良型RPMI-1640購(gòu)自Therom公司；胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；蛋白Marker購(gòu)自Fermentas公司；融合劑PEG1500/DMSO、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑（CFA）和弗式不完全佐劑（IFA）和氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司；Ni-NTA His-Band Resin購(gòu)自Novagen公司；單克隆抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自Southern Biotech公司。

1.4抗原制備與動(dòng)物免疫

將Rosetta（DE3）/pET32a（+）/gapC1-150aa重組菌劃線(xiàn)接種于含有氨芐青霉素抗性的LB瓊脂平板，37℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落接種于含100 μg·mL-1Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃180 rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，加入終濃度為100 μg·mL-1的IPTG誘導(dǎo)3 h。取誘導(dǎo)后的菌液，離心收集菌體，并用PBS清洗3次，以40%的功率并破碎10 s停10 s的方法進(jìn)行超聲破碎，4℃12 000 rpm離心30 min，收集上清。按照Ni-NTA His-Bind Resin試劑盒說(shuō)明書(shū)純化蛋白，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

按Sanyal等方法[5]，選取6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，三次免疫劑量均為每只小鼠100 μg Gapc1-150aa蛋白，采用背部皮下多點(diǎn)注射，首次免疫注射將蛋白溶液與完全弗氏佐劑等體積乳化，此后兩次免疫注射用弗式不完全佐劑乳化，每次免疫間隔2周；三次免疫之后的第10 d檢測(cè)抗體水平，效價(jià)達(dá)到1∶10 000以上時(shí)可用于細(xì)胞融合。在進(jìn)行融合細(xì)胞的前3 d，以純化的重組蛋白50 μg腹腔注射單獨(dú)抗原對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。將免疫后小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0按照一定比例融合，然后用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

1.5MAb亞類(lèi)的鑒定

按照Southern Biotech公司亞類(lèi)鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。

1.6間接ELISA

用一定濃度的純化后抗原蛋白100 μL包被96孔酶標(biāo)板，4℃條件下包被過(guò)夜。用PBST洗滌3次，用5%脫脂乳作為封閉液，封閉1 h，用PBST洗滌5次，以篩選的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，SP2/0作為一抗陰性對(duì)照，每孔加入100 μL，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，用PBST洗滌5次，用HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）100 μL為二抗，同樣在37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，在用PBST洗滌5次，采用TMB顯色，于波長(zhǎng)450 nm測(cè)定OD值，陽(yáng)性血清孔的OD450 nm值接近1.0，陰性血清OD450 nm值＜0.2，P/N＞2.1判為陽(yáng)性[6]。

1.7Western blot分析

將純化的重組蛋白與5×SDS-PAGE Loading Buffer按一定比例混合，使蛋白濃度達(dá)到1 μg·μL-1，在沸水浴中3 min后，吸取5 μL，在濃縮膠為5%和分離膠為12%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，濃縮膠和分離膠分別以80 V和120 V的電壓進(jìn)行電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)印到NC膜，以110 mA的穩(wěn)流進(jìn)行75 min的轉(zhuǎn)膜[7]，轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用含5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，PBST（Tween-20，0.05%）洗滌3次，加入三種單抗的腹水和SP2/0腹水，室溫感作1 h，PBST洗滌3次，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG （1∶5 000），室溫感作1 h，PBST洗滌3次，用3，3′二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物溶液進(jìn)行顯色，蒸餾水終止反應(yīng)。

1.8單抗的調(diào)理活性檢測(cè)

首先將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞調(diào)整到2×105個(gè)·mL-1，分別將細(xì)胞分到6孔細(xì)胞板中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，備用。將甘油保存的停乳鏈球菌LS0312株、無(wú)乳鏈球菌LS0310株、乳房鏈球菌SD0306株細(xì)菌分別在BHI培養(yǎng)板上劃線(xiàn)37℃培養(yǎng)，第二天挑取單菌落接入2 mL無(wú)抗性液體BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 nm值為0.5～0.6，將這三種鏈球菌按照1∶100接入200 mL BHI液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后，通過(guò)倍比稀釋進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。將大量培養(yǎng)的細(xì)菌用PBS洗滌3次后，用DMEM重懸分裝到離心管中，將細(xì)菌量濃度調(diào)整為1×108cfu·mL-1，每管200 μL菌液。將單抗各10 μg加入含有200 μL細(xì)菌管中，在37℃培養(yǎng)箱中共孵育培養(yǎng)15 min。然后將每200 μL混合液加入每個(gè)貼壁的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的實(shí)驗(yàn)孔中，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)30 min，促進(jìn)吞噬。30 min后從培養(yǎng)箱中取出6孔板，用無(wú)菌的PBS反復(fù)洗滌并倒掉上清液體，加入冰浴的去離子水2 mL，在室溫條件下放置30 min，促使細(xì)胞溶解。最后吹打6孔板中的細(xì)胞裂解物，按1∶10，1∶100，1∶1 000進(jìn)行系列稀釋?zhuān)〕?00 μL涂BHI培養(yǎng)板計(jì)數(shù)。

1.9小鼠被動(dòng)免疫保護(hù)作用試驗(yàn)

將培養(yǎng)的新鮮菌液收集離心，用無(wú)菌PBS洗3次，通過(guò)平板計(jì)數(shù)后，用無(wú)菌PBS將細(xì)菌稀釋為6× 108cfu·mL-1，備用。選擇6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，分為5組，即每株單抗為一組，共三組；另設(shè)GapC1-150aa血清陽(yáng)性對(duì)照組和SP2/0上清陰性對(duì)照組。每組10只小鼠，每只小鼠尾靜脈注射單抗200 μg，24 h之后通過(guò)腹腔注射菌液100 μL，每天觀(guān)察小鼠攻毒后死亡情況。

2　結(jié)果

2.1MAb雜交瘤細(xì)胞株的建立

分別以純化的0.5 μg Gapc1-150aa和FnBPA（含有與Gapc1-150 aa相同標(biāo)簽作為陰性對(duì)照）作為包被抗原包被酶標(biāo)板，用間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔上清，被檢抗體效價(jià)大于陰性對(duì)照OD450 nm值2倍以上者判為陽(yáng)性，經(jīng)3次克隆化篩選獲得了3株能穩(wěn)定分泌抗GapC1-150 aa蛋白的MAb雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1F2、1E11和5B7；給每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL弗式不完全佐劑，7天后每只小鼠注射雜交瘤細(xì)胞5×106個(gè)，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，用間接ELISA測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果腹水效價(jià)均能達(dá)到1∶128 000。

2.2MAb亞型鑒定

按照Southern Biotech公司亞類(lèi)鑒定試劑盒對(duì)MAb的亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果為3株單克隆抗體的重鏈均為IgG1、輕鏈均為κ鏈，經(jīng)進(jìn)一步表位鑒定，三株單抗針對(duì)的表位序列分別為為T(mén)RINDLT、TGFFASK、DTTQGRFDGT。

2.3單抗分泌的穩(wěn)定性

以0.5 μg·孔-1的GapC1-150 aa蛋白為抗原包被酶標(biāo)板，通過(guò)間接ELISA方法檢測(cè)原始和凍存后的雜交瘤細(xì)胞上清，結(jié)果原始雜交瘤細(xì)胞單抗效價(jià)為1∶2 560、1∶640和1∶320，凍存后雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)均為1∶320，原始雜交瘤細(xì)胞經(jīng)過(guò)體外連續(xù)傳代10代以上，單抗效價(jià)不變，證明篩選出的三株雜交瘤細(xì)胞具有穩(wěn)定分泌抗體的能力。

2.4抗體特異性檢測(cè)

分別以0.5 μg·孔-1的重組GapC1-150 aa蛋白和金黃色葡萄球菌的ClfA、Trap、FnBPA、IsdA以及Cna蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，用間接ELISA檢測(cè)3株單抗與各抗原的反應(yīng)，以確定單抗的特異性。結(jié)果，三株單抗均能與重組GapC1-150aa蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而與金黃色葡萄球菌ClfA、Trap、FnBPA、IsdA以及Cna蛋白均不發(fā)生反應(yīng)，表明實(shí)驗(yàn)得到的3株單克隆抗體是針對(duì)GapC1-150aa蛋白。

為了鑒定所獲得的三株MAb的特異性，將重組GapC1-150aa蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以三株單抗作為一抗進(jìn)行western blot檢測(cè)，同時(shí)設(shè)和SP2/0上清作為對(duì)照。三株單抗雜交瘤細(xì)胞分泌上清均與GapC1-150aa蛋白發(fā)生反應(yīng)，在約35KD處出現(xiàn)特異性條帶，而SP2/0則沒(méi)有反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用western blot方法檢測(cè)了三株單抗與停乳鏈球菌GapC、停乳鏈球菌GapC1-150aa、無(wú)乳鏈球菌GapC、乳房鏈球菌GapC以及金黃色葡萄球菌GapC的特異性反應(yīng)，結(jié)果，獲得的三株MAb均能與停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、乳房鏈球菌的GapC蛋白和停乳鏈球菌GapC1-150aa蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，但不與金黃色葡萄球菌的GapC蛋白發(fā)生反應(yīng)，詳見(jiàn)圖1。

2.5單抗相對(duì)親和能力

以2 μg·mL-1濃度的GapC1-150aa蛋白（100 μL·孔-1）抗原包被酶標(biāo)板，分別將3株單抗稀釋成0.5 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1和0.125 μg·mL-1的濃度作為一抗進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果所獲得的三株單抗均具有較強(qiáng)的親和能力，結(jié)果詳見(jiàn)圖2。

圖1　3株單抗與不同菌株GapC之間的交叉反應(yīng)Fig.1Cross reaction between 3 McAbs and recombinant GapC from different strains

圖2　單抗親和能力的測(cè)定Fig.2Affinity of monoclonal antibodies

2.6單抗與全菌體反應(yīng)

用培養(yǎng)4 h小時(shí)的停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和乳房鏈球菌全菌體以108cfu·mL-1的濃度作為抗原包被酶標(biāo)板（100 μL·孔-1），分別以單抗1F2、1E11、5B7、抗GapC1-150aa血清和抗Trap單抗作為一抗，進(jìn)行全菌體ELISA檢測(cè)。結(jié)果，1F2、1E11與陰性對(duì)照組差異顯著，而5B7與陰性對(duì)照組差異極顯著，結(jié)果詳見(jiàn)圖3。結(jié)果說(shuō)明這三株單抗均與全菌體發(fā)生結(jié)合，也說(shuō)明三株單抗所對(duì)應(yīng)的抗原位點(diǎn)位于菌體表面。

2.7單抗的調(diào)理活性

為了檢測(cè)單抗的調(diào)理功能，我們分別用三株單抗與停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和停乳鏈球菌進(jìn)行調(diào)理吞噬試驗(yàn)。結(jié)果，三株單抗1F2、1E11和5B7對(duì)三種鏈球菌的調(diào)理作用與陰性對(duì)照相比差異顯著，但弱于GapC1-150aa的調(diào)理作用，結(jié)果詳見(jiàn)圖4。說(shuō)明三株單抗1F2、1E11和5B7具有明顯的調(diào)理活性。

圖3　3株單抗與3種不同鏈球菌的全菌體反應(yīng)Fig.3 ELISA results of 3 MAb and 3 different Streptococcus

圖4　3株單抗對(duì)3種鏈球菌的調(diào)理吞噬結(jié)果Fig.4Opsonization of three mAbs to different streptococcus

2.8單抗的被動(dòng)免疫保護(hù)作用

為了檢測(cè)三株單抗在體內(nèi)的是否能夠?yàn)闄C(jī)體提供抗鏈球菌感染作用，用小鼠采進(jìn)行了被動(dòng)免疫保護(hù)試驗(yàn)。結(jié)果，SP2/0腹水對(duì)照組小鼠在致死性攻毒后17 h全部死亡，而單抗1F2組小鼠在致死性攻毒后存活36 h，單抗1E11組小鼠在致死性攻毒后存活34 h，單抗5B7組小鼠在致死劑量攻毒后存活44 h， GapC1-150aa抗血清組小鼠存活96 h，說(shuō)明3株單克隆抗體在體內(nèi)對(duì)鏈球菌感染具有一定的抑制作用，如表1所示。

表1　實(shí)驗(yàn)小鼠S.dysgalactiae LS0312株攻毒后存活時(shí)間Table 1Survival time of mice to S.dysgalactiae LS0312

3　討論

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是生物能量代謝途徑中的關(guān)鍵酶，它將可逆性的轉(zhuǎn)化為1，3-二磷酸甘油酸，具有轉(zhuǎn)鐵蛋白活性和纖溶酶活性，轉(zhuǎn)鐵蛋白為鏈球菌提供鐵離子，纖溶酶結(jié)合有利于葡萄球菌侵入宿主的組織細(xì)[8-9]。有研究證明存在高度保守的GAPDH活性蛋白有兩種：GapC和GapB蛋白，所有的鏈球菌中都含有GapC基因，它的GAPDH活性能夠刺激T、B細(xì)胞的增殖和分化，增加細(xì)胞因子IL-10和CD69的表達(dá)，對(duì)細(xì)菌的生存起到很重要的作用[9-10]。已有研究表明乳房鏈球菌GapC蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，對(duì)乳房鏈球菌的保護(hù)率高達(dá)70%，而全菌體免疫組的保護(hù)率僅為30%，表明GapC蛋白具有很高的免疫原性[11]。本文篩選出抗停乳鏈球菌GapC1-150aa三株單克隆抗體，單克隆抗體的初步純化主要用飽和辛酸—硫酸銨沉淀法，然后利用rProteinG試劑盒對(duì)篩選出的三株單克隆抗體進(jìn)行進(jìn)一步純化，純度能達(dá)到95%以上。實(shí)驗(yàn)通過(guò)間接ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)方法說(shuō)明，篩選出的1F2、1E11和5B7單克隆抗體對(duì)GapC1-150aa具有特異性，并且三株單克隆抗體能夠與三種鏈球菌的GapC發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明在停乳鏈球菌GapC1-150aa上的三株單抗所針對(duì)的抗原位點(diǎn)在引起奶牛乳房炎的三種鏈球菌中高度保守，而且位于菌體表面，是引起機(jī)體長(zhǎng)生抗體應(yīng)答的重要抗原位點(diǎn)[12]，通過(guò)比較停乳鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌和乳房鏈球菌GapC的氨基酸序列顯示，三種鏈球菌GapC氨基酸序列高度保守，其同源性分別為90%、93%和94%。該研究所獲得的三株單克隆抗體可用于檢測(cè)和鑒定奶牛乳房炎鏈球菌病原菌的感染，因此具有重要應(yīng)用價(jià)值；而且三株單抗可用于進(jìn)一步研究和鑒定奶牛乳房炎鏈球菌GapC抗原的B細(xì)胞抗原表位，為進(jìn)一步研究預(yù)防鏈球菌感染引起的奶牛乳房炎表位疫苗提供一定的基礎(chǔ)。

抗體功能研究顯示，三株單克隆抗體具有較高的相對(duì)親和活性和顯著的調(diào)理作用，能夠介導(dǎo)明顯的吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌；被動(dòng)免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)證明三株單抗在小鼠體內(nèi)具有一定的抵抗鏈球菌感染的能力。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，該三株單抗和其對(duì)應(yīng)的抗原表位具有深入研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。因此，對(duì)奶牛乳房炎的防治中始終堅(jiān)持“預(yù)防為主，治療為輔”的基本原則，從安全、經(jīng)濟(jì)、高效等多方面因素積極考慮，采取科學(xué)、合理、規(guī)范、嚴(yán)格的綜合防治措施，才能從根本上預(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生[13]。

參考文獻(xiàn)：

［1］Keefe G P.Streptococcus agalactiae mastitis：a review［J］. Can Vet J，1997，38（7）：429-437.

［2］Kossaibati M A，Esslemont R J.The costs of production diseases in dairy herds in England［J］.Vet J，1997，154 （1）：41-51.

［3］程振濤，奶牛隱性乳房炎的診斷方法與細(xì)菌學(xué)研究［J］.貴州：貴州大學(xué)，2006.

［4］Yu L，F(xiàn)an Z，Ma J，et al.Cross-protective effect of a novel multi-antigen-chimeric vaccine against Streptococcus and Staphylococcus aureus infection in mice［J］.J Med Microbiol.，2014，63（12）：1732-1740.

［5］Sanyal A，Venkataramanan R，Pat tnaik B.Antigenic feat ures offoot-and-mouth disease virus serotype Asial as revealed by monoclonal antibodies and neut ralization-escape mutants［J］.Virus Research，1997（4）：168-173.

［6］陸桂麗.雞傳染性貧血病毒VP2蛋白單克隆抗體的制備與鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（5）：396-400.

［7］杜紅麗，王嵩，王宇鵬，等.干酪乳桿菌表面展示IBDV VP2蛋白［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，26（5）：39-43.

［8］Rosey E L，Lincoln R A，Ward P N，et al.PauA：a novel plasminogen activator from Streptococcus uberis［J］.FEMS Microbiol Lett，1999，178（1）：27-33.

［9］Fang W，Oliver S P.Identification of lactoferrin-binding proteins in bovine mastitis-causing Streptococcus uberis ［J］.FEMS Microbiol Lett，1999，176（1）：91-96.

［10］Goji N，Potter A A，Perez-Casal J.Characterization of two proteins of Staphylococcus aureus isolated from bovine clinical mastitis with homology to glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase［J］.Vet Microbiol，2004，99（3-4）：269-279.

［11］Madureira P，Baptista M，Vieira M，et al.Streptococcus agalactiae GAPDH is a virulence-associated immunomodulatory protein［J］.J Immunol，2007，178（3）：1379-1387.

［12］張輝.奶牛乳房炎性鏈球菌GapC重組蛋白的免疫保護(hù)性研究［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，10（36）：810-812.

［13］葉倩.奶牛乳房炎防治的研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014（1）：59-61.

Preparation and Biological Activities of 3 Monoclonal Antibody Strains Against GapC1-150aafrom Streptococcus dysgalactiae

Wei Yuhua1，Zhang Limeng1，Zhou Xue2，F(xiàn)an Ziyao2，Yu Yongzhong2，Wu Zhijun2，Sun Hunan2，Yu Liquan2，Cui Yudong2
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University）

Abstract:In order to futher study the antigenicity of GapC1-150aafrom Streptococcus dysgalactiae，three monoclonal antibodies （McAbs）specific to GapC1-150aafrom Streptococcus dysgalactiae were developed by cell fusion with the BALB/c mice immunized with purified prokaryotic expression GapC1-150aaprotein based on indirect-ELISA.The specific study demonstrated that 1F2，1E11 and 5B7 were identified as subclass IgG1 and the light chain belongs κ chain.Results of western-blotting with purified GapC from three dysgalactiae indicated that the McAbs 1F2，1E11 and 5B7 had specific characters against GapC while they had no reactivity with other proteins.Passive immunity protection experiment had proved that 3 McAb can provided a degree of protection.

Key words：Streptococcus dysgalactiae；GapC；monoclonal antibody

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.655

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1002-2090（2016）01-0053-06

doi:10.3969/j.issn.1002-2090.2016.01.012

收稿日期：2015-03-06

作者簡(jiǎn)介：魏玉華（1989-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

通訊作者：崔玉東，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：1016856109@qq.com。