梁果義甘一迪劉曉航蔡祥勝

（1. 北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，北京 100043；2. 南方醫(yī)科大學生物治療研究所，廣州 510515）

重組胰島素原在畢赤酵母中高效分泌表達的研究

梁果義1甘一迪1劉曉航1蔡祥勝2

（1. 北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，北京 100043；2. 南方醫(yī)科大學生物治療研究所，廣州 510515）

為了提高胰島素在酵母的分泌表達效率，首先合成了胰島素原基因，并在其序列的N端引入了一段引導肽，構建成pPICZα-A-Pro-INS重組分泌型表達載體。將表達載體線性化處理后電擊轉化畢赤酵母GSll5感受態(tài)細胞，篩選獲得分泌型高表達工程菌株，重組蛋白的表達水平為300 mg/L，占分泌總蛋白的40%左右。該結果表達明引導肽的存在對于在畢赤酵母中高效表達胰島素的基因至關重要。

胰島素；畢赤酵母；高效表達；引導肽

糖尿病是一種全身性慢性疾病，病因復雜，并發(fā)癥多，治愈率低，成為國際醫(yī)學的一大難題，被世界衛(wèi)生組織稱為不死的癌癥。胰島素是治療糖尿病最基礎、最有效的藥物，也是FDA批準的第一個用于人類的基因重組藥物。目前，胰島素作為重組蛋白產品，主要有兩條途徑獲得。一條途徑是在大腸桿菌中表達胰島素前體的包涵體，通過溶解和復性等過程獲得胰島素；另外一條途徑是通過酵母表達系統(tǒng)，分泌表達可溶性的胰島素前體進入培養(yǎng)液［1］。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)許多優(yōu)點，例如，可對表達的蛋白進行翻譯后加工與修飾、具有強的可控的醇氧化酶基因強啟動子、表達載體是整合在染色體上、糖基化程度低使其所分泌的糖蛋白的免疫原性較低利于臨床應用等。目前，在畢赤酵母中已有許多基因成功的實現(xiàn)了高效表達，如破傷風毒素基因在畢赤酵母中表達后，其產量達12 g/L［2］；而來源于人的人血清蛋白基因經(jīng)表達后，其產量達10 g/L［3］。然而仍有些蛋白的表達水平較低，甚至表達出來沒有活性。因此，我們還需進一步研究提高外源蛋白在其體內的表達。

近年來，也有很多學者研究利用畢赤酵母來分泌表達胰島素的基因，然而由于該基因自身的一些特點，多數(shù)研究表達胰島素的量均較低?，F(xiàn)在已有一些研究通過優(yōu)化表達核的啟動子、拷貝數(shù)、對宿主菌進行改良、優(yōu)化培養(yǎng)條件等方法來提高胰島素的表達量［4］。盡管這些方法可以在一定程度上提高其表達量，但是現(xiàn)有的文獻報到，其表達量較低。早在1996年，Kjeldsen等［5，6］在釀酒酵母中表達完整的人胰島素原cDNA基因時，發(fā)現(xiàn)胰島素原蛋白大部分累積在胞內而不能分泌到胞外，而將編碼胰島素原cDNA分子中的β鏈中的第30位氨基酸去除，并接上短的C肽鏈，且與釀酒酵母的α交配因子前導肽相融合，則可以有效的提高單鏈胰島素原的分泌表達量。在此基礎上，Kjeldsen等［7，8］也在畢赤酵母中成功的表達胰島素原基因，且在前導肽與外源蛋白之間引入一段間隔肽——EEAEAEAEPK，這樣在前導肽的引導下，表達的胰島素原可以正確的折疊，形成正確的二硫鍵以及提高其分泌表達量。劉海峰等［9］利用畢赤酵母表達人胰島素原基因時，在胰島素原基因的N末端引入同樣的一段間隔肽——EEAEAEAEPK，發(fā)現(xiàn)雖然其可以提高目的蛋白的表達量，但間隔肽中多個酶切位點造成胰島素原蛋白N末端的不均一性。利用間隔肽還可促進其它的基因如S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因［10］和植酸酶基因［11］等在畢赤酵母中的分泌表達。

胰島素工程菌的表達量一直是困擾胰島素制備的一個難題，本研究結合前人研究的基礎，重新設計胰島素酵母表達的方式。采用pPICZαA載體，在分泌信號肽和胰島素原之間引入一段間隔肽，構建載體轉化酵母受體菌GS115，利用zeocin抗性篩選高拷貝重組子，表達驗證來獲得高表達胰島素的酵母工程菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10 感受態(tài)細胞購自天根生化科技（北京）有限公司，畢赤酵母菌株GS115由本實驗室保存；大腸桿菌-畢赤酵母穿梭質粒載體pPICZα-A由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 T4 DNA連接酶、限制性內切酶（Xho I和NotI）、PfuDNA聚合酶、dNTP及DNA Maker（DL2000）均購自大連TaKaRa公司；博來霉素（Zeocin）購自Invitrogen公司，胰蛋白胨（Trypsin）和酵母提取物（Yeast extract），英國Oxoid公司；質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自美國Omega公司其他化學試劑均為國產分析純，購自北京化學試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl，調節(jié)pH值至7.0（固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）。（2）YPG培養(yǎng)基：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，2%甘油（固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）。（3）完全培養(yǎng)基YPD：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖。（4）誘導表達培養(yǎng)基BMGY：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，1.34%YNB，2%甘油，10 mmol/L磷酸鉀（pH6.0）、生物素4×10-5%（無菌過濾加入）。（5）誘導表達培養(yǎng)基BMMY：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，1.34%YNB，0.5%甲醇，10 mmol/L磷酸鉀（pH6.0）、生物素4×10-5%（無菌過濾加入）。

1.2 方法

1.2.1 胰島素原的cDNA序列的合成及酵母表達重組載體的構建 在參閱文獻以及前期相關研究的基礎之上，充分考慮到目的蛋白的分泌表達、酶切、純化回收等各個環(huán)節(jié)，確定其引導肽的序列為EEAEAEAKR，根據(jù)Codon Usage database（http://www. kazusa.or.jp/codon/）P. Pastoris密碼子使用偏好性數(shù)據(jù)，設計甘精胰島素原類似物核苷酸序列，在序列后面設計兩個TAA終止密碼子序列，并在序列5'端和3'端分別設計Xho I（CTCGAG）和Not I（GCGGCCGC）限制性酶切位點。具體序列為“CTCG AGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTAAGAGA TTCGTCAACCAGCACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTG AGGCCTTGTACTTGGTCTGTGGTGAGCGTGGTTTCTT CTACACCCCAAAGACCAGACGTGGTATCGTTGAGC AGTGTTGCACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAGTTGG AGAACTACTGTGGTTAATAAGCGGCCGC”。

委托生金維智生物科技有限公司對本公司設計完整的cDNA序列進行全基因合成，并將上述全基因合成的cDNA插入PUC57質粒，構建重組質粒PUC- Pro-INS。用限制性內切酶Xho I和Not I酶切，利用質粒膠回收試劑盒回收目的基因片段并保存。然后將目的基因連入表達載體pPICZα-A。

1.2.2 重組酵母菌株的轉化和誘導表達

1.2.2.1 畢赤酵母感受態(tài)細胞的制備 挑取畢赤酵母GS115單菌落接種到裝有5 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，30℃，200 r/min培養(yǎng)過夜。取5 mL過夜菌液到100 mLYPD中30℃，200 r/min培養(yǎng)，OD600=1.2-2.0收菌。 將50 mL菌液移入離心管，4℃，1 600×g離心5 min，無菌徹底去掉上清。 用10 mL 1mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，4℃，1 600×g離心5 min，無菌去掉上清。用10 mL1mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，4℃，1 600×g離心5 min，反復5次。用1 000 μL 1 mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，冰水浴備用。

1.2.2.2 畢赤酵母的電轉化 取80 μL酵母感受態(tài)細胞菌液至預冷的0.2 cm電轉杯中，加入線性化的質粒20 μL濃縮質?；靹颍帽? min（或-20℃放置1 min）。將電轉杯放入電轉儀中電轉（電壓2.0 kV，電擊時間5 ms）。立即加入1 mL預冷無菌1 mol/L的D-Sorbitol，靜止60 min。取200 μL菌液涂布MD板，平放30℃烘箱20-60 min，再倒放培養(yǎng)3-5 d。

1.2.2.3 篩選畢赤酵母多拷貝重組子 用無菌牙簽隨機挑取在YPG-Zeocin平板上生長較快的微量畢赤酵母重組子到含不同Zeocin濃度（300 μg/mL、600 μg/mL）的固體平板上，同一重組子在不同Zeocin濃度的固體平板上編相同的號碼。根據(jù)整合的外源基因的拷貝數(shù)與Zeocin抗性大小之間的計量依賴關系，可推斷僅在低濃度Zeocin平板上長出來的細胞為低拷貝重組子，在高濃度Zeocin平板上長出來的細胞為高拷貝重組子。恒溫箱設置為30℃，靜置培養(yǎng)3-5 d。每日檢查不同Zeocin濃度平板出現(xiàn)的菌落。

1.2.2.4 畢赤酵母重組子的誘導表達搖瓶篩選 分別在含100 μg/mL、300 μg/mL、600 μg/mL Zeocin的YPD平板上挑取不同拷貝數(shù)的重組子菌落，接種于100 mL BMGY培養(yǎng)液的1 000 mL搖瓶中，30℃搖床培養(yǎng)約16-24 h至OD600為2-6時，無菌條件下更換等體積的BMMY培養(yǎng)液進行誘導，28℃繼續(xù)培養(yǎng)120 h，每隔24 h補加終濃度為0.5%的甲醇。誘導結束離心后，上清液用三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）沉淀。配制試劑液50%的TCA加入0.2%的去氧膽酸鈉，取25%的試劑液與75%的培養(yǎng)基離心上清液（體積比）混合均勻，在冰塊上放置30 min。離心（4℃，20 000×g，20 min），倒去上清液，用10%的TCA懸浮，離心（條件同上）。倒去上清液，用冷丙酮（-20℃）再懸浮，離心（條件同上）。用吹風機吹干沉淀，用SDS buffer溶解濃縮進行電泳或HPLC檢測。

2 結果

2.1 酵母陽性轉化子的篩選

將轉化有胰島素表達核的重組畢赤酵母，分別點在含100 μg/mL、300 μg/mL、600 μg/mL Zeocin的YPD平板上進行培養(yǎng)，來篩選整合有高拷貝表達核的重組子，平板結果見圖1。從圖1可以明顯發(fā)現(xiàn)，有些酵母的基因組中可能整合了多個拷貝的基因表達核，可能會高效表達胰島素的基因。

圖1 轉化子抗性平板篩選的結果

挑選整合有高拷貝的8株轉化子，進行搖瓶誘導表達培養(yǎng)，并檢測其表達胰島素的量，蛋白質電泳結果見圖2。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)胰島素可以被高效誘導分泌表達到胞外，重組蛋白的表達水平最高可以達到到300 mg/L，占分泌總蛋白的40%左右。文獻報道［12］沒有加前導肽的畢赤酵母轉化子中，胰島素獲得的最高分泌表達量僅為32 mg/L。在胰導素前體的N端加上前導肽后，可以提高其表達量約為10倍。

2.2 工程菌誘導表達蛋白的質譜測定

將表達的胰島素前體從SDS-PAGE電泳中切下后進行色譜純化，從色譜圖（圖3）中可以發(fā)現(xiàn)該蛋白出峰的保留時間約為14.9 min，純度為100%。將獲得的重組胰島素前體進行質譜測定其分子量為7.08 kD，與其理論分子量7.08 kD基本一致，該結果初步表明表達的重組蛋白質為胰島素前體。在此基礎上，對目標條帶進行一級質譜檢測（圖4），選取信號強度較好的兩個肽段進行二級質譜，并搜索Mascot 數(shù)據(jù)庫，分析表明檢測的蛋白質為胰島素前體中的蛋白質片段，從而證明胰島素原在畢赤酵母中成功實現(xiàn)表達。

圖2 蛋白質電泳結果

圖3 回收樣品HPLC色譜圖

圖4 質譜檢測結果

3 討論

利用基因重組技術在體外大量制備活性多肽是目前生物制品研究的熱點之一。對于許多分子較小的多肽，如果用常規(guī)方法構建單拷貝基因的重組質粒，則目的基因在細胞中的表達量很低，無法體現(xiàn)基因工程產量高的優(yōu)勢，其原因是表達產物的分子太小，在細胞中不穩(wěn)定，容易被宿主蛋白酶降解。因此，建立一套適合小分子肽表達的體系，以實現(xiàn)小分子多肽在體外的高效表達極為重要。

畢赤酵母作為目前應用最成功的一種外源基因真核表達系統(tǒng)，可以高效分泌表達外源基因，然而許多基因由于基因自身的性質，很難在該表達系統(tǒng)中得到高效表達，其中胰島素就是其中的一個例子。有研究通過提高胰島素基因表達核的拷貝數(shù)，優(yōu)化發(fā)酵條件、啟動子等方法可以提高其分泌表達量，但是其表達量依然很低。本研究發(fā)現(xiàn)在其N端融合一種前導肽，可以提高其分泌表達量，也再次表明，蛋白質N端的序列和其在畢赤酵母中的分泌表達密切相關。但到目前為止，仍還不清楚為什么這段前導肽能大幅度提高胰島素前體表達量的原因。另外關于其應用的普遍性也需要進一步的研究。

優(yōu)化發(fā)酵條件，提高酵母的產量，實現(xiàn)目的多肽的高表達。用發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)能大量提高表達量。這是因為在發(fā)酵罐中，溶解氧水平、通氣量、PH攪拌速度、營養(yǎng)補給等方面更容易得到優(yōu)化，有機體能高密度生長，也可獲得目標產物更高效的表達。分泌表達可穩(wěn)定表達產物，減少蛋白水解酶作用。對已經(jīng)篩選出來的菌株，通過優(yōu)化發(fā)酵條件可進一步提高分泌表達量。

4 結論

本研究構建了pPICZα-A-Pro-INS重組載體；將表達載體轉化畢赤酵母GSll5，利用Zeocin抗生素篩選高抗重組菌株；重組子甲醇誘導表達篩選獲得高表達菌種，基本上與其Zeocin濃度呈正相關，蛋白的表達水平最高可達300 mg/L，占分泌總蛋白的40%左右；獲得的重組胰島素前體分子量為7.08 kD，與其理論分子量一致。

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（責任編輯 李楠）

Study on the Highly Secreted Expression of the Recombinant Insulin in Pichia pastoris

LIANG Guo-yi1GAN Yi-di1LIU Xiao-hang1CAI Xiang-sheng2
（1. Beijing SL Pharmaceutical Co.，Ltd.，，Beijing 100043；2. Institute of Biotherapy of Southern Medical University，Guangzhou 510515）

In order to improve the efficiency of insulin secretion expression in yeast，firstly the pro-insulin gene was synthesized，and a recombinant secreted expression vector（pPICZα-A-Pro-INS）was constructed by inserting a leader peptide to N-end of the gene’s sequence. Linearized expression vector was transformed into the competent cells of Pichia pastoris GSll5. A strain with highly secreted expression of the insulin was screened，by which the secreted recombinant protein expression level was 300 mg/L，accounting for about 40% of the total secreted protein. This result revealed that the leader peptide is crucial to the gene of highly expressing insulin in P. pastoris.

insulin；Pichia pastoris；highly expression；leader peptide

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.033

2015-09-30

梁果義，男，研究生，研究方向：生物醫(yī)藥；E-mail：guoyi_liang@163.com