楊亞藍(lán) 郭志云 丁若凡 茆燦泉 郭建秀 熊莉麗

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031）

阿霉素誘導(dǎo)下的肝癌細(xì)胞HepG2中微小RNA差異表達(dá)分析

楊亞藍(lán) 郭志云 丁若凡 茆燦泉 郭建秀 熊莉麗

（西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031）

旨在研究阿霉素誘導(dǎo)引起的DNA損傷壓力下，肝癌細(xì)胞HepG2中參與DNA損傷應(yīng)答的miRNA，并分析這些miRNA靶基因參與肝癌DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程與通路。通過小RNA測序檢測阿霉素處理肝癌細(xì)胞HepG2前后miRNA的差異表達(dá)情況，使用GO與KEGG通路富集方法對差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果顯示，共檢測出顯著表達(dá)差異miRNA 68個，其中上調(diào)13個，下調(diào)55個。miRNA靶基因的功能分析結(jié)果顯示，53條miRNAs靶基因顯著富集于調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和細(xì)胞周期等與DNA損傷應(yīng)答以及腫瘤相關(guān)的生物進(jìn)程和信號通路，包括p53信號通路、癌癥通路、Wnt信號通路和MAPK信號通路等。研究表明，在阿霉素誘導(dǎo)下，HepG2中的差異表達(dá)miRNAs與DNA損傷相關(guān)的腫瘤生物學(xué)進(jìn)程以及信號通路顯著相關(guān)，預(yù)示這些miRNAs在阿霉素引發(fā)的肝細(xì)胞癌DNA損傷應(yīng)答中起著重要的作用。

阿霉素；肝細(xì)胞癌；DNA損傷；小RNA測序；microRNAs

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma）是人類最常見的惡性腫瘤之一［1，2］。MiRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA，長度在22個核苷酸左右，它主要是通過特異性結(jié)合靶基因3'非翻譯區(qū)（3'UTR）抑制靶基因的翻譯或者直接誘導(dǎo)靶基因的降解從而調(diào)控下游靶基因參與的生物進(jìn)程［3］。研究表明miRNAs參與了由DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的多種細(xì)胞生物過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡等［4，5］。Andrea等［6］發(fā)現(xiàn)，原癌基因miR-27a在人肺腺癌細(xì)胞A549 DNA損傷反應(yīng)中起到重要的作用，其主要通過直接調(diào)控ATM基因進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖。小RNA測序技術(shù)（small RNA sequencing）作為一種高通量的miRNA檢測技術(shù)，目前廣泛應(yīng)用于miRNA表達(dá)譜的檢測。本研究利用抗癌藥物阿霉素處理肝癌細(xì)胞株HepG2，使細(xì)胞產(chǎn)生特異的DNA損傷，并運(yùn)用小RNA測序技術(shù)檢測阿霉素處理前后肝癌細(xì)胞株HepG2的miRNAs表達(dá)譜，篩選出DNA損傷前后差異性表達(dá)miRNAs，旨在為進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞HepG2由本實驗室保管；阿霉素購自sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素以及胎牛血清購自Hyclone公司；Trizol Regent購自Invitrogen公司；測序由華大基因公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2用含有10%胎牛血清（Hyclone），100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素（Hyclone）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco）培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對數(shù)期5.0×106個細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待長至80%左右，加入0.2 μg/mL的阿霉素（北京華豐）處理HepG2細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取及質(zhì)量檢測 收集經(jīng)阿霉素處理前后HepG2細(xì)胞，按TRIzol（Invitrogen）實驗說明書抽提細(xì)胞總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀（百泰克）鑒定RNA的純度及完整性。

1.2.3 Small RNA文庫構(gòu)建及測序 使用15%PAGE膠分離不同片段大小的RNA，回收18-30 nt的片段在T4 RNA連接酶作用下加5'和3'測序接頭將產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄為雙鏈并擴(kuò)增。使用PAGE膠對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收及純化，回收產(chǎn)物溶于EB溶液中，完成文庫建立。使用Agilent 2 100 Bioanalyzer和StepOnePlus Real-Time PCR System對構(gòu)建好的small RNAs文庫進(jìn)行質(zhì)量及產(chǎn)量評估。參照Illumima HiSeq 2 500測序儀說明書完成small RNAs文庫測序。

1.2.4 Small RNA測序數(shù)據(jù)分析 Illumina HiSeq 2 500測序得到長度為49 nt的序列，通過數(shù)據(jù)處理去除3'端缺失、5'端污染、插入片段缺失、含polyA等序列后獲得高質(zhì)量clean reads。對clean reads的長度、質(zhì)量和分布等進(jìn)行統(tǒng)計、分類和注釋。通過bowtie將sRNA定位到基因組，分析reads在基因組上的分布及表達(dá)情況。使用bowtie將reads與miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，注釋已知miRNAs。通過bowtie將sRNA和GeneBank、Rfam數(shù)據(jù)庫比對，注釋除miRNA以外的sRNA，沒有比對到注釋信息的sRNA用unann表示。

1.2.5 差異表達(dá)miRNAs分析 篩選實驗組與對照組文庫差異表達(dá)miRNA，將兩個文庫中的miRNA歸一化處理后進(jìn)行倍數(shù)變化值（fold change）和P值統(tǒng)計計算。篩選顯著性差異表達(dá)miRNA的具體標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）reads數(shù)大于10；（2）|log2（fold change）|>1；（3）P<0.05。

1.2.6 miRNAs靶基因預(yù)測、功能分析 利用Targetscan（http://www.targetscan.org/）［7］、miRanda（http://www.microrna.org/microrna/ home.do）［8］和miRDB（http://www.mirdb.org/miRDB/）［9］數(shù)據(jù)庫對顯著性差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測，通過取交集來降低靶基因預(yù)測假陽性率。將預(yù)測靶基因與實驗驗證靶基因庫TarBase（http://diana.imis.athenainnovation.gr/DianaTools/index.php?r=tarbase/index）［10］取并集得到每個miRNA的靶基因數(shù)據(jù)集。利用DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）［11，12］對 每 個miRNA的靶基因進(jìn)行Gene Ontology［10］富集分析和KEGG信號通路分析，以P<0.05為顯著性閾值。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取和檢測

使用0.2 μg/mL阿霉素處理HepG2細(xì)胞0 h和24 h后，TRIzol試劑抽提樣本中總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀檢測總RNA含量和質(zhì)量。各組樣本總RNA的OD260/OD280均在1.8-2.0之間，樣品濃度在500-1 000 ng/μL之間。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示2個樣品的28S和18S電泳條帶清晰，灰度比大于1.9，質(zhì)量合格，可用于后續(xù)測序?qū)嶒灐?/p>

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 對照組和實驗組樣本中small RNA占比柱狀圖

圖3 對照組與實驗組樣本miRNA種類的比較

圖4 差異表達(dá)miRNAs散點圖

2.2 小RNA測序數(shù)據(jù)分析

測序得到對照組和實驗組總reads分別為11 519 591條和12 110 255條，高質(zhì)量數(shù)據(jù)占總數(shù)的98.95%和97.96%。通過bowtie將sRNA與miRbase、Rfam和GenBank等數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行sRNA種類注釋。正如預(yù)期，sRNA中miRNA占有最高的比例，對照組和實驗組中miRNA占比分別為53.01%和45.51%（圖2）。對照組樣本中檢測到888種成熟miRNAs，實驗組樣本中檢測到790種成熟的miRNA，兩個樣本中均表達(dá)的有679種（圖3）。

2.3 阿霉素處理組與對照組樣本miRNAs差異表達(dá)分析

將阿霉素處理組和對照組miRNA的表達(dá)量豐度進(jìn)行比較后共得到127個差異表達(dá)miRNA（P<0.05）（圖4）。通過進(jìn)一步篩選得到顯著差異表達(dá)miRNA共68條（13條上調(diào)miRNA，55條下調(diào)miRNA）（表1）。上調(diào)最為顯著的是hsa-miR-449c-5p（上調(diào)50.14倍）。miR-17-92基因簇中的miR-19b、miR-20a、miR-18a、miR-92a-1在本實驗中均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。

2.4 差異表達(dá)miRNA功能富集分析

運(yùn) 用Targetscan、miRanda、miRDB和TarBase四種軟件組合預(yù)測了差異表達(dá)miRNAs的靶基因（參照材料與方法部分）。通過GO富集分析和KEGG信號通路分析對每個表達(dá)差異的miRNA靶基因進(jìn)行功能注釋（P<0.05）。我們發(fā)現(xiàn)68條表達(dá)差異miRNAs中有53條miRNAs的靶基因顯著參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞遷移等與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的生物進(jìn)程和信號通路，如p53信號通路（最小P值=6.90E-09）、MAPK信號通路（最小P值=2.60E-05）、癌癥中通路（pathways in cancer）（最小P值=5.10E-10）等（圖5）。其中hsa-miR-148a-3p（最小P值= 1.20E-08）、hsa-miR-122-5p（最小P值= 1.80E-06）、hsa-miR-182-5p（最小P值= 2.50E-11）、hsa-miR-19b-3p（ 最 小P值= 3.70E-06）、hsa-miR-20a-5p（最小p值= 1.20E-11）高度富集于多個與DNA損傷相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程和信號通路中（圖5）。

表1 68個顯著性差異表達(dá)miRNAs的倍數(shù)變化表格

3 討論

本研究選用抗癌藥物阿霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2 DNA損傷，通過對處理前后HepG2細(xì)胞的sRNA進(jìn)行高通量測序，得到與DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的差異表達(dá)miRNAs，并分析這些miRNA靶基因參與肝細(xì)胞癌DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程與信號通路的情況。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA介入多種與DNA損傷以及由DNA損傷誘發(fā)的細(xì)胞生物過程中，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等，其在DNA損傷引起的腫瘤生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮重要功能［13，14］。

圖5 miRNA-靶基因參與癌癥相關(guān)的生物過程和信號通路熱圖

本研究篩選出具有顯著性差異表達(dá)miRNAs 68個，其中表達(dá)上調(diào)的13個，表達(dá)下調(diào)的55個。上調(diào)miRNAs中hsa-miR-122-5p、hsa-miR-1-3p等參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和侵襲等多個與DNA損傷相關(guān)的生物進(jìn)程和信號通路。最新研究表明，在肝癌細(xì)胞系HepG2中過表達(dá)miR-122可以有效促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［15］；Xu等［16］也報道m(xù)iR-122作為腫瘤抑制因子，通過負(fù)調(diào)控M2型丙酮酸激酶（PKM2）抑制肝癌細(xì)胞生長，這與本實驗阿霉素誘導(dǎo)DNA損傷后激活p53相關(guān)信號通路并上調(diào)miR-122進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡和抑制肝癌細(xì)胞增殖的結(jié)果相吻合。另外，miR-1已被證實為腫瘤抑制因子，它通過下調(diào)惡性腫瘤發(fā)展相關(guān)的內(nèi)皮素1（EF1）從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖［17］。本實驗中，我們檢測到miR-27a-5p下調(diào)，Andrea等［6］發(fā)現(xiàn)，原癌基因miR-27a在人肺腺癌細(xì)胞A549的DNA損傷反應(yīng)中起到重要的作用，研究結(jié)果表明DNA損傷會引起miR-27a的下調(diào)并間接促進(jìn)miR-27a靶基因——抑癌基因ATM的表達(dá)進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和生存，本研究與之前的研究一致。我們的結(jié)果顯示，miR-17-92基因簇的miR-18a-5p、miR-92a-1-5p、miR-20a-5p和miR-19b-3p 表達(dá)均下調(diào)。研究表明miR-17-92基因簇是極為重要的致癌基因，在肝癌中高表達(dá)［18］。Yan等［19］發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境導(dǎo)致的DNA損傷會誘導(dǎo)p53過表達(dá)進(jìn)而下調(diào)原癌基因miR-17-92表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程。miR-17-92基因簇具有原癌基因的功能，參與調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等生理進(jìn)程，Zhu等［20］通過RT-PCR和原位雜交實驗證實了miR-17-92基因簇在肝癌組織中高表達(dá)，阿霉素處理后會激活p53調(diào)控的凋亡通路，因此miR-17-92基因簇的下調(diào)會有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖。綜上所述，這些受肝細(xì)胞癌DNA損傷影響的差異表達(dá)miRNAs在阿霉素誘導(dǎo)的DNA損傷應(yīng)答進(jìn)程中起著重要的作用。

4 結(jié)論

本研究分析了阿霉素誘導(dǎo)下肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2中miRNA差異表達(dá)情況，共檢測出顯著差異表達(dá)的miRNA 68條，其中上調(diào)13個，下調(diào)55個。MiRNA靶基因功能結(jié)果顯示，53條miRNAs顯著富集于與DNA損傷應(yīng)答關(guān)聯(lián)的生物進(jìn)程和信號通路中，其中hsa-miR-148a-3p（最小P值= 1.20E-08）、hsa-miR-122-5p（最小P值= 1.80E-06）、hsa-miR-182-5p（最小P值= 2.50E-11）、hsa-miR-19b-3p（最小P值= 3.70E-06）、hsa-miR-20a-5p（最小P值= 1.20E-11）高度富集于多個DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的通路中，預(yù)示這些miRNA在肝細(xì)胞癌HepG2的DNA損傷應(yīng)答過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Differential Expression Profile Analysis of MicroRNAs in Doxorubicininduced Hepatoma Cell Line HepG2

YANG Ya-lan GUO Zhi-yun DING Ruo-fan MAO Can-quan GUO Jian-xiu XIONG Li-li
（School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031）

The aims of this work are to study the miRNAs of hepatoma cell HepG2 involving in the response to doxorubicin-induced DNA damages，and to analyze the these miRNAs target genes and the biological processes and pathways related to the response to the hepatoma DNA damages. Small RNA sequencing was used to detect the differentially expressed miRNAs between doxorubicin-treated hepatocellular carcinoma cell line HepG2 and untreated one，and the functions of target genes were analyzed by GO（gene ontology）and KEGG pathway enrichment. Remarkably，68 significantly differentially-expressed miRNAs were identified，13 miRNAs were up-regulated and 55 were down-regulated. After the functional analysis of miRNA targets，the 53 miRNAs were enriched in the biological processes of cell proliferation，cell apoptosis，cell invasion and cell cycle arrest，as well as the pathways of p53 signal，cancer，Wnt signal and MPK，etc. The results demonstrate that these differentially-expressed miRNAs are correlated with DNA damage response-related biological processes and signaling pathways，indicating the prominent importance of these miRNAs in the doxorubicin-induced DNA damage response in hepatocellular carcinoma.

doxorubicin；hepatocellular carcinoma；DNA damage；small RNA sequencing；microRNAs

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.036

2015-12-21

國家自然科學(xué)基金資助項目（31200999），中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項資金資助（2682013BR022）

楊亞藍(lán)，女，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lynneyyl@126.com

熊莉麗，女，博士，講師，研究方向：非編碼RNA結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：xllllx@yeah.net