楊先友 黃有軍 張通 黃春穎

（浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，杭州 311300）

擬南芥轉錄激活因子AtWRI1研究進展

楊先友 黃有軍 張通 黃春穎

（浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室培育基地，杭州 311300）

油脂具有較高的經濟價值，研究植物油脂合成的調控過程具有重要意義。轉錄激活因子WRI1在油脂合成調控中起關鍵作用。綜述了AtWRI1的發(fā)現(xiàn)及其結構特征、表達模式、功能和調控機制。AtWRI屬于AP2/EREPB家族中的AP2亞族，具有7個外顯子，在植物各器官的不同發(fā)育時期均有表達，但在種子的油脂合成時期表達量最高。它與相應的順式作用元件結合，能夠轉錄激活糖酵解和脂肪酸合成相關基因的表達，從而促進油脂的合成。AtWRI1是AtLEC1和AtLEC2的下游基因；在CRL3-BPM復合體介導下，AtWRI1通過泛素-26S蛋白酶體途徑降解。

油脂合成；AtWRI1；表達模式；轉錄激活；調控機制

油脂不僅是人類和動物不可或缺的食物，也是重要的工業(yè)原料，具有較高的經濟價值［1］。油料種子積累的油脂主要以三酰甘油（triacylglycerols）的形式存儲于油體中，為種子萌發(fā)和形態(tài)建成提供碳源和能量［2］。三酰甘油是丙三醇和脂肪酸的酯化物，主要通過Kennedy途徑合成［3，4］。

模式植物擬南芥屬于十字花科植物，其種子含油量高，是研究脂代謝的理想載體。通過分析擬南芥基因表達譜發(fā)現(xiàn)，在不同發(fā)育階段，質體中的乙酰CoA羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACCase）4種亞基（BC、BCCP、α-CT和β-CT）的表達量幾乎不變［4］；參與同一個代謝過程的多數(shù)基因具有相似的表達譜［5］，表明轉錄調控在油脂合成過程中具有重要作用，從而為高油作物遺傳育種工作指明了方向。WRINKLED1（WRI1）是目前唯一確定的特異性正向調控糖酵解和脂肪酸合成過程的轉錄激活因子，具有重要研究意義［6］。近年來已相繼在擬南芥、油菜、玉米等多種植物中找到了該基因，并對AtWRI1的生物學功能做了深入研究。丁霄等［7］報道了WRI1在主要作物中的研究現(xiàn)狀。綜述了擬南芥AtWRI1的研究進展，主要從AtWRI1的發(fā)現(xiàn)、表達模式、生物學功能和調控機制加以闡述，為將來WRI1的深入研究提供參考。

1 AtWRI1的發(fā)現(xiàn)及其結構特征

一般而言，油脂密度小于蛋白質和碳水化合物。因此，如果種子含油量降低，種子密度則會相應增加?；谶@樣的假設，1998年，F(xiàn)ocks和Benning［8］對經化學誘變處理獲得的M2群體通過種皮形態(tài)結構和密度的觀測，篩選到包括wri1-1在內的若干等位擬南芥突變體 。wri1-1突變體種子胚中的質體丙酮酸激酶（plastidial pyruvate kinase，PKp）的活性僅為野生型的28%，甚至比pkpβ1pkpα雙突變體更低［9］，這說明了WRI1的重要性。與表面皺縮的豌豆相似［10］，由于種皮發(fā)育正常而脂類物質含量減少，wri1突變體種子干燥后發(fā)生明顯皺縮，因此該基因被命名為WRINKLED1（WRI1）。wri1-1在種子淀粉含量，形態(tài)建成和光合能力方面與野生型擬南芥沒有差異，但種子（包括胚乳和胚）含油量大幅下降，油體結構異常［11］，脂肪酸組分發(fā)生變化，可溶性糖含量增加，蛋白含量略有減少，種皮褶皺，胚發(fā)育延緩，下胚軸生長不正常，發(fā)芽率和可育性降低。通過對該突變體進行遺傳作圖、酶活測定和轉錄組測序等實驗證實了AtWRI1是一個與油脂合成相關的轉錄激活因子，調控糖酵解和脂肪酸合成效率。Cernac和Benning［12］通過圖位克隆和遺傳學方法確定了AtWRI1的基因座（At3G54320）。

AtWRI1具有兩個AP2結構域，定位在細胞核，屬于AP2/EREPB家族中的AP2亞族，與胚珠及花發(fā)育相關轉錄因子AINTEGUMENTA（ANT）具有較高的相似性［13］。在NCBI的GENE數(shù)據(jù)庫中顯示W(wǎng)RI1同源基因具有相似的內含子-外顯子結構。包括AtWRI1在內的多數(shù)WRI1基因具有7個外顯子，其中第三個外顯子僅含9個核苷酸，高度保守，對應WRI蛋白第一個AP2結構域內的3個氨基酸殘基（VYL）（圖1）。這3個氨基酸對AtWRI1的生物學功能具有重要作用［14］。AtWRI1具有At3G54320.1、At3G54320.2和At3G54320.3三種剪接體，但在擬南芥種子和其他組織的轉錄組數(shù)據(jù)庫中僅檢索到At3G54320.3。目前關于AtWRI1的研究均以At3G54320.3為研究對象，本文中的AtWRI1均指At3G54320.3。

圖1 AtWRI1基因和對應蛋白結構示意圖

2 AtWRI1表達模式與功能研究

基因表達模式與其功能密切相關，深入研究WRI1的表達模式有利于開展其功能研究。AtWRI1在種子、莖、葉、根和花中都有表達，但在種子中表達量最高［12］。糖酵解過程為脂肪酸合成提供原料，該過程的關鍵基因PKp1和PKp2在胚中的表達模式與AtWRI相近，對應的突變體表型與wri相似［15］，反映了AtWRI1在糖酵解調控過程中的重要作用。糖異生過程涉及到許多糖酵解相關酶，存在于各個器官與組織中，說明AtWRI1在莖、根等器官中有少量表達。將AtWRI1的啟動子區(qū)域（起始密碼子前的1 028 bp）和報告基因GUS構建表達載體并在擬南芥中表達發(fā)現(xiàn)，AtWRI1在胚和胚乳發(fā)育的早期已有少量表達；到魚雷形胚時，在胚根和子葉外圍的表達較強；隨著胚的發(fā)育，逐漸向子葉內部擴展，但在種皮中始終未見表達。擬南芥油脂主要在胚和胚乳中積累，AtWRI1表達的組織特異性與之一致。在開花后第8-10天，AtWRI1在角果中的表達達到峰值，恰好是種子開始積累油脂的階段。之后其mRNA豐度緩慢降低；但到種子成熟階段其表達維持在較低水平還是快速增強還存有爭議［12，16］。

突變體是功能基因組學研究的重要材料，目前TAIR已收集到5個wri等位突變體，其中wri1-1在第一個內含子的第一個堿基發(fā)生點突變（G>A）導致異常剪接，不能正常翻譯出該轉錄因子，進而不能正常積累油脂。2002年，Ruuska等［5］對不同發(fā)育時期wri1-1種子的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析發(fā)現(xiàn)，與野生型擬南芥種子相比，其1%基因的表達受到顯著影響，絕大多數(shù)是在野生型擬南芥中具有單峰表達譜的碳水化合物代謝相關基因或脂肪酸從頭合成相關基因。轉錄激活因子與其靶基因具有相似的表達模式，并且在表達豐度上呈正相關［17］。利用基因芯片雜交、定量PCR和Western-blot等技術分析wri1突變體和AtWRI1超量表達株的基因表達明確了AtWRI1的轉錄調控作用。目前已確定其靶基因多是糖酵解相關基因和脂肪酸從頭合成相關基因，在野生型擬南芥中具有相似的表達譜。多數(shù)靶基因在突變體中仍有本底表達，與酶活測定的結果相一致［18］，而多數(shù)靶基因在AtWRI1超量表達株中表達量增加，雖然增加幅度遠不如AtWRI1。wri突變體中的靶基因的本底表達表明AtWRI1是在種子發(fā)育的特定階段激活相關基因的表達，而另有其他功能因子維持這些基因的本底表達。二酰甘油?；D移酶（Acyl-CoA：diacylglycerol acyltransferase1，DGAT1）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SUS2）和脂肪酸延長酶（fatty acid elongase1，F(xiàn)AE1）在wri突變體中表達減弱，但AtWRI1的超量表達沒有使之表達增強，且它們的表達譜與其他靶基因不同，推測AtWRI1需要與其他功能因子協(xié)同作用才能轉錄激活這些基因［19］。在超量表達株中，AtWRI1和其靶基因表達水平不同幅度的提升也證明了這一觀點。AtWRI1和其靶基因之間在表達上存在一定的時間差。wri-1中脂肪酸修飾或Kennedy途徑相關基因的表達沒有受到明顯影響，AtWRI1超量表達株和wri突變體中脂肪酸組分的變化與之相一致。AtWRI通過調控糖酵解和脂肪酸合成過程促進油脂合成，而不直接參與脂肪酸修飾和三酰甘油合成過程。由Nitrogen Regulatory Protein PII 1-like（GLB1）編碼的PП蛋白通過影響ACCase活性從而負向調控脂肪酸生物合成［20，21］。AtGLB1也被AtWRI1正向調控，體現(xiàn)了生物調控網(wǎng)絡的復雜性與精密性。此后，To等［22］又獲得了AtWRI1的3個旁系同源基因，即AtWRI2、AtWRI3和AtWRI4。AtWRI2在不同組織都有表達，但不能轉錄激活AtWRI1的靶基因，這可能是由于它的第二個AP2結構域存在較大變異而導致的。AtWRI2沒有參與到油脂合成的調控過程中，可能具有其他的生物學功能，目前對該基因的研究較少。AtWRI3和AtWRI4主要在葉和花器官中表達，也能促進脂肪酸合成，對應突變體花瓣表面角質中的雙羧基脂肪酸和ω-羥基脂肪酸含量減少，花瓣粘連在一起。AtWRI3和AtWRI4調控角質中脂肪酸的合成，而AtWRI1調控儲存脂中脂肪酸的合成，三者在功能上既相互聯(lián)系又相互區(qū)別。需要說明的是，對于不同基因型的擬南芥，WRI1促進油脂合成的能力不同，這可能是由內源基因表達模式決定的［23］。Ws型擬南芥中油脂合成相關基因的表達水平不是限制油脂合成的因素；因此就促進油脂合成的作用而言，在Ws中AtWRI1的超量表達作用不如在Col中明顯。

Maeo等［19］將報告基因GUS與AtWRI1靶基因的啟動子區(qū)域構建表達載體和AtWRI1共轉入擬南芥原生質體中確定了與AtWRI1結合的順式作用元件。通過序列分析發(fā)現(xiàn)AtWRI1靶基因啟動子區(qū)域內具有保守性較強的序列，被稱為AW-box［CnTnG］（n）7［CG］（n為任意核苷酸）。許多AtWRI1靶基因啟動子區(qū)域具有2個AW-box，都是具有功能的順式作用元件。AW-box緊鄰轉錄起始位點（TSS）或在5'UTR內，與TSS的距離應不超過400 bp，否則不能特異性表達。Tabach等［24］曾報道CArG-box及NF-KB-motif的轉錄激活效率及其與TSS之間的距離直接相關。2個AW-box之間的距離也能影響WRI1的轉錄激活的組織特異性［25］。兩個核心motif即［TnCnG］和［CG］被7個任意核苷酸隔離，核心motif上發(fā)生任意點突變都會減弱AtWRI1蛋白與它的結合程度。AtWRI1定位在細胞核，完整的結構是其生物學活性的前提［26］。這兩個motif可能分別與AtWRI1蛋白的兩個AP2結構域發(fā)生作用。Baud等［23］確定了AtWRI1靶基因啟動子區(qū)域內的另一個順式作用元件， 即15-bp element（5'-cAAAAG（t/g）Agg（a/g）gttT-3'）。通過分析轉錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)在油棕中果皮表達的若干油脂合成相關基因也具有AW-box，但沒有發(fā)現(xiàn)15-bp element［27］。AtWRI1靶基因啟動子區(qū)域內還存在其他保守性較低的元件，或許也能與AtWRI1蛋白或其他因子相互作用?；虻谋磉_與調控是一個復雜的過程，這兩個不同的順式作用元件可能在依賴AtWRI1的調控網(wǎng)絡中具有不同的作用。另外，通過酵母單雜交實驗發(fā)現(xiàn)BnWRI1能夠與GT1-element和GCC-box發(fā)生作用，說明不同物種之間依賴WRI1的調控機制也不盡相同。

3 AtWRI1調控機制

植物具有復雜的代謝調控網(wǎng)絡以適應不斷變化的環(huán)境和不同的發(fā)育狀態(tài)。轉錄因子調控靶基因的表達，因此對于轉錄因子的調控至關重要［28］。AtWRI1在擬南芥中存在轉錄和轉錄后兩個不同水平的調控機制。LEC2與胚發(fā)育相關，能夠激活AtWRI1的表達［29-31］，而lec2突變體中AtWRI1的表達下降，表達譜改變，在wri1-1突變體中超表達AtLEC2不能增加種子油脂含量。這些說明AtLEC2是AtWRI1的上游基因，其功能的發(fā)揮需要AtWRI1的介導。AtLEC2的另一個下游基因AtLEAFY COTYLEDON1（LEC1）也正向調控AtWRI1的表達［32］。wri1-1突變體中mRNA豐度異常高，表達譜也發(fā)生變化，AtWRI1活性的干擾實驗也得到類似的結果，推測擬南芥中存在著反饋調節(jié)機制調控AtWRI1的表達。選擇性剪接是許多基因的調控方式［33］，AtWRI1也存在選擇性剪接。AtWRI1第三外顯子僅有9個核酸，屬于micro-exons［34］，對應AtWRI蛋白第一個AP2結構域內“VYL”3個氨基酸殘基（圖1）。這3個氨基酸在WRI同源基因中高度保守，具有重要作用，且多數(shù)由第3個僅含9個核苷酸的外顯子翻譯而來。該外顯子的作用可能是調控AtWRI1的轉錄激活［35］。許多轉錄因子通過復合體（同源或異源）的形式發(fā)揮作用，而在截短或修飾后則能干擾復合體的形成或其轉錄激活作用［36］。AtWRI1具有不同的剪接體，是否存在這種調控機制仍需進一步研究。轉錄因子的泛素化和之后通過26S蛋白酶體的降解對于其功能的實現(xiàn)具有重要作用。蛋白泛素化是一個極為復雜的過程，植物體內有近1 500種蛋白-泛素連接酶（E3），CULLIN-RING泛素連接酶（CRL）是其中主要的一種。BTB/POZ-MATH（BPM）在C端和N端分別具有BTB/POZ和MATH結構域［37］，在ERF/AP2家族蛋白的泛素化過程中具有重要作用［38］。CRL3是CRL的一個亞族，能與BPM形成復合體以泛素化AtWRI1蛋白，被泛素化的AtWRI1蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解。

4 展望

代謝過程中的一個酶促反應對于整個過程的影響是有限的［39］，而WRI1可在種子發(fā)育的特定階段單獨起作用或與其他作用因子相結合，轉錄激活參與糖酵解和脂肪酸合成過程中的重要基因，從而影響油脂合成過程。目前已一定程度地了解了AtWRI1的調控網(wǎng)絡（圖2），是基因改良工程可行的重要基因；若結合其他基因的操控能更為有效地提高植物種子或營養(yǎng)器官的含油量，改變脂肪酸組分［40，41］，因此WRI1具有很高的應用價值。

圖2 AtWRI1的調控網(wǎng)絡

AtWRI1在油脂合成過程中具有重要作用，理解AtWRI1的作用機制是利用該基因促進油脂合成的基礎，在如下幾個方面仍需深入研究。（1）AtWRI1存在不同的剪接體，但目前對AtWRI1的選擇性剪接和不同剪接體的功能研究較少。（2）AtWRI1異常表達會引起發(fā)芽率降低，形態(tài)建成不正常，目前還無法確定是由AtWRI1的異常表達直接引起，還是由油脂含量異常、代謝狀態(tài)改變、信號轉導受阻等因素間接引起。（3）在AtWRI1超量表達株中，相對于AtWRI1表達量的增加，其靶基因的表達量并沒有大幅增加；酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)AtWRI1可以自激活，推測AtWRI1蛋白以二聚體或多聚體（同源或異源）形式發(fā)揮轉錄激活功能，其機理尚需進一步研究。（4）AtWRI啟動子區(qū)域順式作用元件及其蛋白三維結構特征的分析有利于揭示它的作用機制。（5）AtWRI1蛋白的減少會引起AtWRI1轉錄水平的提高，關于AtWRI1的反饋調節(jié)機制需進一步研究。

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（責任編輯 狄艷紅）

Advances on Transcriptional Activator AtWRI1 of Arabidopsis

YANG Xian-you HUANG You-jun ZHANG Tong HUANG Chun-ying
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A&F University，Hangzhou 311300）

As lipid has high economic value，studying the regulation process in oil biosynthesis is of great significance. WRI1，a transcriptional activator，plays a key role in this process. This paper focuses on its identification and structural characteristics，expression pattern，function and the regulation mechanism of AtWRII. It belongs to AP2 subtribe of AP2/EREB family and has 7 exons. It expresses at different developmental stages of each organ，and the expressional level reaches the maximum at the oil synthesis stage of seeds. Through binding corresponding cis-function components，it activates the transcription of genes involving in glycolysis and fatty acid synthesis，and consequently promotes the oil synthesis. AtWRII is one of the downstream genes of AtLEC1 and AtLEC2. Mediated by CRL3-BPM complex，AtWRI1 is degraded via ubiquitin-26S proteasome pathway.

oil synthesis；AtWRI1；expression pattern；transcriptional activation；regulation mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.004

2015-09-06

楊先友，男，碩士研究生，研究方向：森林培育學經濟林；E-mail：yangxianyou8@163.com

黃有軍，男，博士，副教授，研究方向：植物發(fā)育生物學；E-mail：youjunhuang@163.com