吳淼經(jīng)，汲乾坤，范陽華，呂世剛，葉敏華，吳　雷，祝新根

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌　330006)

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◇基礎(chǔ)研究◇

著絲粒蛋白W在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其對侵襲的作用

吳淼經(jīng)，汲乾坤，范陽華，呂世剛，葉敏華，吳雷，祝新根

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西南昌330006)

摘要：目的探討著絲粒蛋白W(centromere protein W, CENP-W)在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及與預(yù)后的相關(guān)性，并探討其對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲作用的影響。方法在高級別膠質(zhì)瘤組織、低級別膠質(zhì)瘤及瘤旁正常腦組織中，采用蛋白質(zhì)印跡法、實(shí)時熒光定量PCR法檢測CENP-W的表達(dá)水平，并統(tǒng)計(jì)分析表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，應(yīng)用特異性siRNA干擾U251細(xì)胞中CENP-W表達(dá)使其下調(diào)后，通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA對U251細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果膠質(zhì)瘤組織CENP-W表達(dá)水平明顯高于正常腦組織，并且與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)性；轉(zhuǎn)染成功后，與空白對照組及陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染CENP-W-siRNA組的細(xì)胞侵襲及遷移能力均下降，Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗(yàn)顯示低表達(dá)CENP-W患者的PFS明顯長于高表達(dá)組。結(jié)論CENP-W表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理級別呈正相關(guān)，CENP-W可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的侵襲，預(yù)示CENP-W可作為膠質(zhì)瘤治療新靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：著絲粒蛋白W；腦膠質(zhì)瘤；侵襲；

腦膠質(zhì)瘤是常見的成人惡性腦腫瘤，確診后5年存活率小于3%，預(yù)后極差[1-2]。其生長迅速且呈惡性侵襲性發(fā)展，雖可采用手術(shù)切除、放化療以及生物治療等多方案對腫瘤進(jìn)行干預(yù)，但腫瘤仍可在短時間內(nèi)復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者的生命安全，至今仍是神經(jīng)外科最棘手的問題，其本質(zhì)上是一種多基因異常疾病，針對與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因異常的治療已成為研究熱點(diǎn)[3]。

著絲粒蛋白W(centromere protein W, CENP-W)是一個新發(fā)現(xiàn)的致癌基因，于2007年首次被報道[4]，研究表明CENP-W廣泛高表達(dá)于卵巢、肝臟、肺、結(jié)腸、胃、胰腺等多種癌癥組織中，最初因確定為一個假定的致癌基因而被命名為腫瘤上調(diào)蛋白-2(cancer-upregulated gene 2, CUG2)[4-5]。但是，CENP-W在腦膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制尚不明確。本文通過檢測不同級別膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中CENP-W表達(dá)水平、并通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)至U251細(xì)胞分析CENP-W在腦膠質(zhì)瘤中的作用機(jī)制及與侵襲的關(guān)系，為腦膠質(zhì)瘤的基因治療靶點(diǎn)提供新的思路。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源及臨床資料共納入腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本63例，均取自2011年1月至2014年12月于南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，其中男性36例，女性27例，年齡19～70歲，平均49.2歲。按照WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)(2007)進(jìn)行分級：25例低級別腦膠質(zhì)瘤中20例低級別星形細(xì)胞瘤(WHO Ⅰ～Ⅱ級)和5例少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(WHO Ⅱ級)；38例高級別膠質(zhì)瘤中16例間變性星形細(xì)胞瘤(WHO Ⅲ級)和22例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的(WHO Ⅳ級)。正常對照組：顱腦外傷手術(shù)切除的正常腦組織(12例)，并其基線資料可比。本研究獲得所有患者的知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2實(shí)驗(yàn)材料及來源人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室存儲；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購自美國HyClone公司；針對CENP-W基因序列的特異性小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)，CENP-W、β-actin的PCR引物由美國Invitrogen公司設(shè)計(jì)并合成；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、QRT-PCR試劑盒、LipofectAMINE2000均購自日本TaKaRa公司；蛋白抽提試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；兔抗人CENP-W多克隆抗體購自美國RayBiotech公司，Transwell板購自美國Corning公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3Real-time PCR檢測腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中CENP-W mRNA的表達(dá)用Trizol提取細(xì)胞總RNA，TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以qPCR檢測各組CENP-W mRNA的表達(dá)量。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s。采用SYBR Green熒光染料摻入法在美國ABI 7300擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40次循環(huán)。CENP-W基因的上下游引物分別為：5′-AGTGGTGACTTATTGGTCCATCTG-3′和5′-AAGCGTTTGTCCTGGACTCTTC-3′。GAPDH的上

下游引物分別為：5′-GTTGGAGGTCGGAGTCAACGG-3′和5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3′。整個反應(yīng)過程中熒光信號的變化由qPCR儀監(jiān)測。2-△△CT為RWDD3 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4蛋白質(zhì)印跡法檢測腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中CENP-W蛋白的表達(dá)提取腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞總蛋白，利用生物分光光度計(jì)比色分析總蛋白含量。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白膠條轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST洗膜后加入膜封閉液，37 ℃封閉2 h，TBST洗膜3次，加入CENP-W(1∶800稀釋)、β-actin內(nèi)參一抗，4 ℃過夜，洗膜3次后加入二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次，置增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑ECL底物中反應(yīng)5 min，TBST洗膜后用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光、定影。利用凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片進(jìn)行灰度掃描和凈吸光度值分析。

1.5隨訪隨訪全部膠質(zhì)瘤術(shù)后患者，無失訪，隨訪時間：6～45個月，記錄患者無進(jìn)展生存期(progress free survival, PFS)，觀察CENP-W表達(dá)水平與PFS的關(guān)系。

1.6細(xì)胞培養(yǎng)與CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染將U251細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、50 mL/L CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。感染前取對數(shù)生長期的U251細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×104個細(xì)胞；使用不含抗生素的含100 mL/L胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到約60%左右時用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，分3組：空白對照組、陰性對照組和CENP-W siRNA組。CENP-W siRNA序列為5′-GCAGAAGAGTCCAGGACAA-3′，陰性對照組siRNA陰性對照序列為5′-GCATGGAGAGAGCAACCAA-3′；轉(zhuǎn)染后24 h后，將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)可見點(diǎn)狀熒光，若熒光細(xì)胞比例占50%以上則判斷為轉(zhuǎn)染成功。

1.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化轉(zhuǎn)染48 h后在Transwell上室中加入1∶2(基質(zhì)膠∶DMEM)稀釋后的基質(zhì)膠60 μL，37 ℃ 30 min使其聚合成凝膠。在下室中加入細(xì)胞條件培養(yǎng)液600 μL。待檢細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，上室中加入1×105個細(xì)胞，24 h后棄上室液體，擦去Transwell小室上室面未穿過膜的細(xì)胞，甲醇固定30 min風(fēng)干后用結(jié)晶紫染色20 min。200倍下計(jì)數(shù)上、中、下、左、右5個視野中粘附細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值. 每組設(shè)4個復(fù)孔，以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)同侵襲實(shí)驗(yàn)，只是Transwell小室上室面不鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余方法同上。

2結(jié)果

2.1Real-time PCR法檢測腦膠質(zhì)瘤組織中CENP-W mRNA表達(dá)差異Real-time PCR檢測正常腦組織，低級別及高級別腦膠質(zhì)瘤組織的CENP-W mRNA相對表達(dá)水平分別為0.46±0.09、0.82±0.04、1.18±0.07。結(jié)果顯示高級別腦膠質(zhì)瘤中CENP-W mRNA表達(dá)水平較正常組及低級別腦膠質(zhì)瘤相比顯著增高，并隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而表達(dá)增高(F=130.2，P<0.000 1，圖1)。

圖1Real-time PCR檢測CENP-W mRNA在膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)

Fig.1 The expressions of CENP-W mRNA in glioma tissues and adjacent brain tissues detected by Real-time PCR

與正常組比較，*P<0.05。

2.2免疫蛋白印跡法檢測腦膠質(zhì)瘤組織中CENP-W蛋白表達(dá)及差異Western blot檢測正常腦組織，低級別及高級別腦膠質(zhì)瘤組織中CENP-W的蛋白相對表達(dá)水平分別為1.00±0.24、4.21±0.64、7.21±0.98，結(jié)果顯示高級別腦膠質(zhì)瘤中CENP-W蛋白表達(dá)水平較正常組及低級別腦膠質(zhì)瘤相比顯著增高，并隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而表達(dá)增高(F=101.5，P=0.000 4，圖2)

圖2Western blot檢測CENP-W蛋白在膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中的表達(dá)

Fig.2 The expression of CENP-W protein in glioma tissues and adjacent brain tissues detected by Western blot

與正常組比較，*P<0.05。

2.3CENP-W的表達(dá)對膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響Kaplan-Meier 生存分析顯示，CENP-W低表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者的無進(jìn)展生存期為18.31月，高表達(dá)組的無進(jìn)展生存期為28.22月，CENP-W單變量分析顯示, CENP-W低表達(dá)患者的PFS明顯長于高表達(dá)組(χ2=18.92，P=0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3CENP-W的表達(dá)水平對膠質(zhì)瘤患者PFS的影響

Fig.3 Comparison of PFS of CENP-W high expression and low-expression group in human gliomas

2.4Real-time PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞CENP-W mRNA表達(dá)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示空白對照組、陰性對照組和轉(zhuǎn)染組(CENP-W siRNA)的CENP-W mRNA值分別為1.35±0.10、1.37±0.05、0.25±0.08，與空白對照組和陰性對照組比較．CENP-W siRNA組細(xì)胞CENP-W mRNA的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=364.0，P<0.000 1)，空白對照組與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4CENP-W siRNA感染U251細(xì)胞對CENP-W 的mRNA表達(dá)的影響

Fig.4 The mRNA expression level of CENP-W in the U251 cells after transfection with CENP-W siRNA detected by Real-time PCR

與陰性對照組和空白對照組比較，*P<0.05。

2.5Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞CENP-W的蛋白表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示空白對照組、陰性對照組和CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染組的CENP-W蛋白表達(dá)值分別為1.00±0.11、1.08±0.09、0.31±0.08，與空白對照組和陰性對照組比較，CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞CENP-W蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=214.2，P=0.0018)，空白對照組與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。

圖5CENP-W siRNA感染U251細(xì)胞對CENP-W蛋白表達(dá)的影響

Fig.5 The protein levels of CENP-W in the U251 cells after transfection with CENP-W siRNA detected by Western blotting

與陰性對照組和空白對照組比較，*P<0.05。

2.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力結(jié)果見圖6。3組穿膜細(xì)胞數(shù)不同，與空白對照組及陰性對照組相比較，CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.13，P=0.001)，空白對照組與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖6轉(zhuǎn)染RWDD3-shRNA對U251細(xì)胞遷移能力的影響

Fig.6 The effects of CENP-W siRNA transfection on the migration ability of the U251 cells (×200)

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：CENP-W轉(zhuǎn)染組；D：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。與陰性對照組和空白對照組比較，*P<0.05。

2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力結(jié)果見圖7。3組穿過基質(zhì)膜細(xì)胞數(shù)不同，與空白對照組及陰性對照組相比較，CENP-W siRNA轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.34，P=0.000 7)，空白對照組與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖7轉(zhuǎn)染CENP-W siRNA對U251細(xì)胞侵襲能力的影響

Fig.7 The effects of CENP-W siRNA transfection on the invasion ability of the U251 cells (×200)

A：空白對照組；B：陰性對照組；C：CENP-W轉(zhuǎn)染組；D：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。與陰性對照組和空白對照組比較，*P<0.05。

3討論

腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后極差，特別是腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的高度血管化惡性腫瘤之一，患者中位生存期不超過12個月，而傳統(tǒng)的治療方法效果較差，因此，急需找到腦膠質(zhì)瘤相關(guān)基因作用靶點(diǎn)，為腦膠質(zhì)瘤的基因治療靶點(diǎn)提供新的思路。

LEE等[4]于2007年通過檢測分析卵巢、肝、肺、腸及胰等8種癌組織與正常組織中發(fā)現(xiàn)了CENP-W異常明顯的高表達(dá)，起初命名為一個假定的致癌基因CUG2(cancer-upregulated gene 2)，CENP-W定位于染色體6q22.32，基因組DNA全長約8 500 bp，包含了3個外顯子，cDNA全長約531 bp，mRNA全長約600 bp，蛋白質(zhì)約10 ku。CENP-W在染色體上的定位區(qū)——人類6號染色體長臂的缺失，在惡性淋巴瘤及卵巢癌等惡性腫瘤中是很常見的染色體改變[6-7]。同時有研究發(fā)現(xiàn)阻斷CENP-W可在哺乳動物細(xì)胞有絲分裂過程中觀察到多極紡錘體和染色體錯位等異常染色體結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，并誘導(dǎo)異常的有絲分裂來影響細(xì)胞的活性[8]。SUZUKI等[9]研究證實(shí)CENP-W/CENP-T是著絲粒內(nèi)板變形允許細(xì)胞分裂時著絲粒拉伸所必需的關(guān)鍵一員。PRENDERGAST等[10]研究發(fā)現(xiàn)CENP-W/T復(fù)合物是其他CCAN蛋白形成的上游(除外CENP-A)，只有CENP-W/T復(fù)合物形成后才能誘導(dǎo)其他著絲粒蛋白的形成和動粒的組裝。

同時有研究報道，將CENP-W基因重組到小鼠胚胎成纖維NIH3T3細(xì)胞中，使其高表達(dá)CENP-W，發(fā)現(xiàn)CENP-W-NIH3T3細(xì)胞和空白對照組相比生長明顯加快，有些細(xì)胞出現(xiàn)瘤變的表型；軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)CENP-W-NIH3T3細(xì)胞株明顯比對照組生長快，同時CENP-W-NIH3T3細(xì)胞的一些轉(zhuǎn)移特性(如細(xì)胞的侵襲力和運(yùn)動能力)明顯增強(qiáng)；在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，CENP-W-NIH3T3細(xì)胞在細(xì)菌培養(yǎng)皿中的密度極高，初步猜測CENP-W高表達(dá)可能使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞失去了細(xì)胞接觸抑制；另外該研究還將高表達(dá)CENP-W的細(xì)胞株行體外成瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CENP-W組無論在成瘤速度還是成瘤大小上都比陽性對照組強(qiáng)，由此推測CENP-W與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11-12]。

綜上研究表明，CENP-W與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，但其具體機(jī)制及與腦膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚不明確。本研究證實(shí)，隨膠質(zhì)瘤惡性程度增高，CENP-W mRNA及蛋白表達(dá)水平增高，進(jìn)一步的CENP-W蛋白分子的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CENP-W升高可以促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤的遷移及增殖能力。研究發(fā)現(xiàn)，性別、年齡與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后關(guān)系不密切[1,13]。我們發(fā)現(xiàn)CENP-W與患者預(yù)后指標(biāo)PFS密切相關(guān)，表明CENP-W與膠質(zhì)瘤的惡性程度及復(fù)發(fā)情況有關(guān)。表明CENP-W對腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用，進(jìn)一步在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)控CENP-W的表達(dá)，進(jìn)而觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、周期、凋亡等生物學(xué)表型的改變及驗(yàn)證其相關(guān)作用通路及機(jī)制是我們進(jìn)一步研究的重要方向。CENP-W作為一個新的腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的重要原因，與患者的預(yù)后密切相關(guān)，其更加深入的研究，為膠質(zhì)瘤的治療有望提供新的靶點(diǎn)。

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(編輯韓維棟)

Expression of CENP-W in gliomas and its effect on invasion of gliomas cells

WU Miao-jing, JI Qian-kun, FAN Yang-hua, Lü Shi-gang, YE Min-hua, WU Lei, ZHU Xin-gen

(Department of Neurosurgery, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression of CENP-W in gliomas and its relationship with clinicopathological parameters and prognosis and to explore the effects of centromere protein W (CENP-W) on the invasion of gliomas cells. MethodsThe expressions of CENP-W in high-grade glioma tissues, low-grade glioma tissues, and adjacent brain tissues were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and Western blotting. The correlation of the expression of CENP-W with clinicopathological parameters and prognosis was analyzed statistically. Human gliomas U251 cells in vitro were transfected with small interfering RNA to downregulate the expression of CENP-W. The invasion and migration capabilities of gliomas cancer cells were assessed by Transwell assays. ResultsThe expression level of CENP-W was significantly higher in glioma tissues than in normal tissues. There was a positive correlation between the three protein expression levels and the pathological grade of gliomas. CENP-W siRNA was successfully transfected into U251 cells. Compared with those of the cells transfected with the scramble siRNA and control cells, the invasive and migration activities were inhibited in the U251 cells transfected with CENP-W siRNA. The Kaplan-Meier analysis and Log-Rank test showed significant differences in progress free survival (PFS) between the CENP-W high-expression and low-expression groups. ConclusionThe expression level of CENP-W was positively correlated with the pathological grade of gliomas and CENP-W can promote glioma cell invasion. It implicates that CENP-W can be a novel target in gliomas treatment.

KEY WORDS:centromere protein W (CENP-W); glioma; invasion

收稿日期：2015-07-26修回日期：2015-10-08

基金項(xiàng)目：江西省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目(No.20132BAB205043)、江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.GJJ14066)

通訊作者：祝新根. E-mail: zxg2008vip@163.com

中圖分類號：R739.41

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201603018

Supported by the Natural Science Foundation of Jiangxi Province (No.20132BAB205043) and Jiangxi Province Department of Education Science and Technology Research Project (No.GJJ14066)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160407.1735.012.html(2016-04-07)