高　慶，高　美，屈　萍，李岐佩，陳　茜

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710004；2.西安高新醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安　710075)

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◇中醫(yī)藥研究◇

氧化苦參堿對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用

高慶1，高美1，屈萍2，李岐佩1，陳茜1

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710004；2.西安高新醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西西安710075)

摘要：目的觀察氧化苦參堿對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其相關(guān)分子機制。方法MTT法檢測氧化苦參堿的抗增殖活性；Transwell小室法檢測氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞增殖的影響；Real-time PCR法檢測氧化苦參堿對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響；Western blot法檢測氧化苦參堿對MMP-2、MMP-9、AKT及p-AKT表達(dá)水平的影響。結(jié)果氧化苦參堿能夠有效抑制HeLa細(xì)胞的增殖，與對照組(0 mg/mL)相比，氧化苦參堿高于0.8 mg/mL時出現(xiàn)明顯差異。低于細(xì)胞毒性濃度(0.8 mg/mL)的氧化苦參堿能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的侵襲能力，隨著氧化苦參堿濃度的升高穿過基質(zhì)膠到達(dá)小室底端的細(xì)胞數(shù)目明顯減少，0.1、0.2和0.4 mg/mL組分別為對照組的(77.07±20.43)%、(53.95±18.17)%、(20.35±11.20)%；0.1、0.2、0.4 mg/mL組MMP-2的RNA水平分別為對照組的(82.76±8.71)%、(39.51±12.79)%、(21.53±5.38)%，0.4 mg/mL組MMP-2的蛋白水平為對照組的(64.69±16.52)%；0.4 mg/mL組AKT的磷酸化水平為對照組的(41.27±7.13)%。結(jié)論氧化苦參堿能夠明顯抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)AKT信號通路的活性進而調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)來實現(xiàn)的。本研究為氧化苦參堿的抗腫瘤機制增添了新的內(nèi)容。

關(guān)鍵詞：氧化苦參堿；宮頸癌；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶

全球范圍內(nèi)，宮頸癌是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的第二大病因[1]。近年來針對人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus, HPV)等早期診斷方法的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，有效地降低了宮頸癌的發(fā)病率和死亡率，并改善了宮頸癌患者的長期生存率[2-4]。但是，很多患者在診斷時已經(jīng)發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，必須接受相應(yīng)的化學(xué)治療，而這些化療藥物毒性較大且存在耐受性差的問題，很多患者在接受化療之后出現(xiàn)化療耐藥，并最終導(dǎo)致患者死亡[5]。

越來越多的證據(jù)顯示，從植物中提取的一些天然藥物在抗腫瘤領(lǐng)域正在被越來越多的專家認(rèn)可，其中最具代表性的是長春新堿和紫杉醇。苦參是中藥苦參根的干燥制劑，而氧化苦參堿是苦參中一種重要的堿性成分，具有抗炎、抗過敏、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等多種功能[6-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿具有明確的抗腫瘤作用[10]?；谝陨?，本研究的目的在于明確氧化苦參堿在宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及其可能機制。

1材料與方法

1.1主要試劑氧化苦參堿分子式為C15H24N2O2，相對分子質(zhì)量為264.36，純度大于98%。實驗之前先利用DMSO將氧化苦參堿溶解制成母液、儲存于-20 ℃冰箱內(nèi)，然后在干預(yù)之前對母液進行稀釋。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞系為本實驗室保有，培養(yǎng)于含有100 mL/L血清的高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、50 mL/L CO2。細(xì)胞2～3 d換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到70%～80%時進行傳代。

1.3細(xì)胞活性的檢測MTT法檢測氧化苦參堿作用后HeLa細(xì)胞的活性。首先取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板中(Corning, USA)(1×103細(xì)胞/孔)，4 h 后待細(xì)胞完全貼壁后加入不同質(zhì)量濃度的氧化苦參堿(0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.5 mg/mL)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL, Sigma-Aldrich)20 μL 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔加入DMSO(Sigma-Aldrich)150 μL，最后將96孔板在酶標(biāo)儀中(Model 3550，Bio-Rad)進行吸光度測量，波長為490 nm。計算公式為：(1-實驗組吸收光度值/對照組吸收光度值)×100%，所有實驗均重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞侵襲實驗取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后利用血清濃度為20 mL/L的培養(yǎng)基制成5×105/mL細(xì)胞懸液，在Tranwell小室上室中，加入含有不同濃度氧化苦參堿的細(xì)胞懸液0.4 mL，下室中加入血清濃度為100 mL/L的常規(guī)培養(yǎng)基。24 h后取出小室對細(xì)胞進行固定，去除上室中殘留細(xì)胞，對下室中細(xì)胞進行固定、染色，其后隨機選取5個視野進行拍照和計數(shù)。

1.5Real-time PCR檢測氧化苦參堿對MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的影響Trizol法提取各組細(xì)胞中總RNA，根據(jù)TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit試劑說明書進行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進行Real-time PCR反應(yīng)并對結(jié)果進行分析，引物設(shè)計見表1，實驗重復(fù)3次。

表1Real-time PCR引物序列

Tab.1Gene-specific primer pairs used for real-time PCR

基因序 列 β-actinCCATCGTCCACCGCAAAT(forward)CATGCCAATCTCATCTTGTTT(reverse)MMP-2CTCATCGCAGATGCCTGGAA(forwardTTCAGGTAATAGGCACCCTTGAAGA(reverse)MMP-9GTCCACCCTTGTGCTCTTCC(forward)GCCACCCGAGTGTAACCAT(reverse)

1.6免疫印跡實驗氧化苦參堿(0.4 mg/mL)作用24 h后，收集細(xì)胞并進行裂解，采用BCA(Bio-Rad)法檢測蛋白濃度，100 g/L SDS-PAGE對樣品進行電泳。電泳完成后利用PVDF膜(Millipore, Billerica, MA)進行轉(zhuǎn)膜，首先在50 g/L脫脂牛奶中將轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜常溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜，次日取出PVDF膜TBST洗膜3次，每次15 min，將PVDF膜放入裝有相應(yīng)二抗的孵育盒中，常溫孵育1 h。將PVDF膜再次用TBST溶液洗滌3次，然后加入發(fā)光液進行發(fā)光，最后進行圖像采集與分析，實驗重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞增殖的影響氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，隨著氧化苦參堿質(zhì)量濃度的升高，其對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強，與對照組相比，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.8 mg/mL時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

2.2氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響本研究前期實驗結(jié)果顯示，氧化苦參堿能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖，這種作用在低于0.6 mg/mL時無統(tǒng)計學(xué)差異。為此，我們選擇低于0.6 mg/mL質(zhì)量濃度的氧化苦參堿作為檢測其抗侵襲能力的實驗濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低于細(xì)胞毒性濃度的情況下，氧化苦參堿能夠明確抑制HeLa細(xì)胞的侵襲能力，這種抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖1氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用

Fig.1 The inhibitory effect of oxymatrine on the proliferation of HeLa cells

與對照組(0 mg/mL)比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3氧化苦參堿對MMP-2、MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響為了進一步檢測氧化苦參堿抑制HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制，我們利用Real-time PCR技術(shù)檢測了氧化苦參堿對MMP-2、MMP-9 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠在mRNA水平明顯抑制MMP-2的轉(zhuǎn)錄，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。但是氧化苦參堿對MMP-9的轉(zhuǎn)錄沒有明顯的抑制作用。

2.4氧化苦參堿對MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響進一步檢測了氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞中MMP-2的蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠明顯抑制MMP-2的蛋白表達(dá)水平，這種作用隨著氧化苦參堿濃度的升高而增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。與Real-time PCR中結(jié)果一樣，氧化苦參堿對MMP-9的表達(dá)沒有明顯的抑制作用。

圖2 氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.2TheeffectofoxymatrineontheinvasionofHeLacellsA:氧化苦參堿0mg/mL;B:氧化苦參堿0.1mg/mL;C:氧化苦參堿0.2mg/mL;D:氧化苦參堿0.4mg/mL;E:Tranwell小室下室中細(xì)胞計數(shù)比較。與對照組(0mg/mL)比較,*P<0.05,**P<0.01。

圖3氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞中MMP-2和MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的影響

Fig.3 The effect of oxymatrine on the expressions of MMP-2 and MMP-9 in HeLa cells

與對照組(0 mg/mL)比較，**P<0.01。

2.5氧化苦參堿對AKT磷酸化水平的影響為了進一步探討氧化苦參堿抑制HeLa細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的可能調(diào)控機制，本研究檢測了氧化苦參堿對AKT信號通路活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠明顯抑制AKT的磷酸化水平(圖5)，提示氧化苦參堿能夠抑制HeLa細(xì)胞的信號通路的活性。

圖4氧化苦參堿對MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Fig.4 The effect of oxymatrine on the expressions of MMP-2 and MMP-9 at the protein level in HeLa cells

與對照組(0 mg/mL)比較，*P<0.05。

圖5氧化苦參堿對AKT信號通路活性的影響

Fig.5 The effect of oxymatrine on the activity of AKT signaling pathway

與對照組(0 mg/mL)比較，**P<0.01。

3討論

苦參在中醫(yī)藥中的應(yīng)用已經(jīng)有上千年的歷史，具有明確的抗炎、抗纖維化和免疫調(diào)節(jié)等功能。氧化苦參堿是苦參中重要的活性成分之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠有效抑制胃癌、胰腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[11-14]。也有研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿可有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的體外增殖能力及裸鼠體內(nèi)的成瘤能力[15]。但至今為止還未見氧化苦參堿對宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用的文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠在體外有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖，且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。低于細(xì)胞毒性劑量的氧化苦參堿干預(yù)后，HeLa細(xì)胞侵襲能力明顯降低，隨著氧化苦參堿濃度的增高，穿過基底膜到達(dá)小室下端的細(xì)胞逐漸減少，呈現(xiàn)明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良和死亡的重要原因。侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生提示宮頸癌患者的治療效果不佳并最終影響患者的預(yù)后。研究表明復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者預(yù)后的最為重要的因素[16]。在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，很多分子與信號通路參與其中，這些分子和信號通路通過在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，最終影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，MMP就是這些分子中的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2和MMP-9在宮頸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，且為多種藥物和分子調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子[17-18]。有研究認(rèn)為MMP-2和MMP-9與宮頸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為判斷患者預(yù)后的標(biāo)志性分子[19-20]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠有效抑制HeLa細(xì)胞中MMP-2的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，提示氧化苦參堿對HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用，與其對MMP-2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用相關(guān)。

AKT信號通路在多種腫瘤的發(fā)生和進展過程中發(fā)揮重要作用，其中就包括宮頸癌[21]。此外，研究發(fā)現(xiàn)抑制AKT信號通路的活性，能夠降低胃癌細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)水平，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲[22]。在宮頸癌細(xì)胞中，AKT信號通路能夠通過有效調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)與活性，進一步影響宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[23]。在宮頸癌HeLa細(xì)胞中，Toll樣受體能夠通過對AKT信號通路活性的調(diào)節(jié)，對多種基因的表達(dá)產(chǎn)生影響[24]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿能夠有效抑制HeLa細(xì)胞中AKT的磷酸化水平，說明其能夠有效抑制AKT信號通路的活性，提示其對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用與其對AKT信號通路的活性抑制相關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿能夠有效抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，而這種作用可能是通過降低AKT信號通路的活性進而抑制MMP-2的表達(dá)來實現(xiàn)的，提示氧化苦參堿是一種潛在的抗宮頸癌藥物。

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(編輯卓選鵬)

Effect of oxymatrine treatment on the invasion of human cervical cancer cells

GAO Qing1, GAO Mei1, QU Ping2, LI Qi-pei1, CHEN Qian1

(1. Department of Obstetricsand Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004; 2. Department of Obstetrics and Gynecology, Xi’an High-tech Hospital, Xi’an 710075, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the anticancer effect of oxymatrine on cervical cancer cell line (HeLa). MethodsMTT assay was used to detect the anti-proliferative effect of oxymatrine. Transwell chamber was used to detect the anti-metastatic effect of oxymatrine. Real-time PCR was used to detect the mRNA levels of MMP-2 and MMP-9. Western blot was used to detect the protein levels of MMP-2, MMP-9, AKT, p-AKT and GADPH. ResultsWe found that application of oxymatrine significantly inhibited the growth of HeLa cells at the concentration above 0.8 mg/mL. We also found that oxymatrine (0.1, 0.2 and 0.4 mg/mL) inhibited the invasion of HeLa cells under cytotoxic dose, which was (77.07±20.43)%, (53.95±18.17)% and (20.35±11.20)% of cells that migrated through the matrigel when compared with those of non-oxymatrine treatment group (P<0.05). Further research found that oxymatrine (0.1, 0.2 and 0.4 mg/mL) could reduce the expression of MMP-2 at the mRNA level, i.e. (82.76±8.71)%, (39.51±12.79)% and (21.53±5.38)% of the expression level when compared with that of non-oxymatrine treatment group (P<0.05). The protein expression level of MMP-2 in 0.4 mg/mL group was (64.69 ±16.52)% of non-oxymatrine treatment group (P<0.05). The phosphorylation level of AKT in 0.4 mg/mL group was (41.27±7.13)% of non-oxymatrine treatment group (P<0.05). ConclusionOxymatrine can inhibit the invasion of HeLa cells by reducing the expression of MMP-2 via inhibiting the activity of AKT signal pathway. All together, our findings bring new insights into the mechanism of the anticancer effects induced by oxymatrine treatment.

KEY WORDS:oxymatrine; cervical cancer; invasion; matrix metalloproteinase (MMP)

收稿日期：2015-06-21修回日期：2015-12-15

基金項目：陜西省自然科學(xué)基金研究計劃資助項目(No.2014JM4143)

通訊作者：陳茜. E-mail: chenqian@mail.xjtu.edu.cn

中圖分類號：R737.33

文獻標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201603030

Supported by the Natural Science Foundation of Shaanxi Provice (No.2014JM4143)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160411.1029.012.html(2016-04-11)