郭昌龍　于　松　王啟迪　曹小芳　楊　英　劉　昕,3　彭左旗　蔡瑞琨

安麗莎1　杜　蒙1,4　邱　月1,4　王興宇1,3　馬　旭1,*

1. 國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所(北京，100081)； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院； 3. 北京高血壓聯(lián)盟研究所；4.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院

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·基礎研究·

子癇前期患者外周血IGH-CDR3免疫組庫的變化

郭昌龍1于松2王啟迪1曹小芳1楊英1劉昕1,3彭左旗1蔡瑞琨1

安麗莎1杜蒙1,4邱月1,4王興宇1,3馬旭1,*

1. 國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所(北京，100081)； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院； 3. 北京高血壓聯(lián)盟研究所；4.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院

摘要目的：探討子癇前期患者外周血中IGH-CDR3序列的多樣性與免疫學特性。方法：分離子癇前期患者外周血中的B淋巴細胞，逆轉錄為cDNA后用ARM-PCR擴增H鏈CDR3區(qū)序列，利用高通量測序并與IMGT數(shù)據(jù)庫對比揭示子癇前期患者IGH-CDR3受體庫的多樣性及免疫學特征。結果：5例子癇前期患者外周血IGH-CDR3 的數(shù)目和種類差別較大，從1127條read到47385 read；子癇前期患者有獨有的免疫學特性，包括IGH-CDR3 長度、N末端堿基的添加數(shù)、V、J區(qū)域使用偏好基因及末端去除的堿基數(shù)；子癇前期患者外周血中存在某些寡克隆異常增殖的情況。結論：子癇前期患者外周血IGH-CDR3 免疫組庫有其獨有的特點。

關鍵詞子癇前期；免疫組庫；IGH-CDR3

妊娠期高血壓疾病(HDCP)是婦女妊娠期所患有的高血壓疾病統(tǒng)稱，分為妊娠期高血壓、子癇前期、子癇、慢性高血壓并發(fā)子癇前期以及慢性高血壓[1]。子癇前期是妊娠期高血壓疾病中較重的類型，對母嬰安全是一個嚴重的威脅，同時也是導致孕產(chǎn)婦及圍生兒死亡的主要原因之一，圍生兒死亡率可高達15%～30%[2]。目前研究顯示除年齡過大或過小(或>40歲<18歲)、多胎妊娠、社會經(jīng)濟狀況差、抗憐脂綜合征、妊娠期高血壓病史及家族史、營養(yǎng)不良[3]等流行病學高危因素外[4]，子癇前期有4個主要的發(fā)病機制學說，包括胎盤或滋養(yǎng)細胞缺血學說、遺傳學說、氧化應激學說、免疫學說[5]。近年來的基礎研究表明，妊娠的成功有賴于母胎免疫平衡，一旦免疫平衡失調，即可引起免疫排斥反應而導致子癇前期和先兆子癇。子癇前期與免疫反應相關的有力證據(jù)包括螺旋小動脈發(fā)育受阻于黏膜段(胎盤淺著床)，且螺旋小動脈管壁出現(xiàn)急性粥樣硬化病變[6]；患者血管壁上可見明顯的免疫球蛋白IgM和補體C3沉積[7]；補體1q越低，補體5b-9顯著增高[8]；90%子癇前期患者胎盤組織缺乏HLA-G抗原表達或表達程度下降等[9]。B 細胞是介導機體體液免疫應答的主要細胞群，其識別、結合抗原主要依賴互補決定區(qū)(CDR)，它決定著抗體的特異性, 而互補決定區(qū)3(CDR3)比CDR1、CDR2 更具多樣性[1]，通過觀察機體B 細胞CDR3 受體庫的多樣性、CDR3區(qū)的基因/氨基酸組成特征、各亞家族的偏向取用等，可以觀察生理及病理狀態(tài)下機體免疫的相關情況[10]。本研究利用最新出現(xiàn)的IGH-CDR3免疫組庫技術結合高通量測序技術研究子癇前期患者外周血中存在的CDR3序列，期待進一步全面揭示子癇前期的發(fā)生、發(fā)展機制，發(fā)現(xiàn)新的免疫相關分子。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究中所選取的5例子癇前期孕婦外周血標本均從北京婦產(chǎn)醫(yī)院獲得，子癇前期孕婦的診斷標準為：①收縮壓≥160 mmHg和(或)舒張壓≥110mmHg；②24h蛋白尿≥2.0g，或隨機蛋白尿(++)以上；③出現(xiàn)持續(xù)性頭痛、視覺障礙等腦神經(jīng)癥狀者；④肝功受損，血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)水平升高；⑤出現(xiàn)上腹部疼痛，肝破裂、肝包膜下血腫等癥狀；⑥血小板持續(xù)性下降，<100x109/L；發(fā)生血管內溶血、貧血等；⑦出現(xiàn)低蛋白血癥，伴發(fā)腹水、胸水等；⑧少尿、血肌酐>106μmol/L；⑨發(fā)生肺水腫、心衰；⑩在妊娠34周以前即發(fā)病；⑾胎兒宮內發(fā)育遲緩、B超提示羊水過少。本研究嚴格遵守赫爾辛基宣言，所有血液標本的取得都獲得了孕產(chǎn)婦本人的同意并簽署了知情同意書，同時本研究獲得了北京婦產(chǎn)醫(yī)院與本所倫理委員會的同意。

1.2 PBMC分離、RNA提取、ARM-PCR擴增、高通量測序

分別采集每個研究對象的外周靜脈血8ml，肝素鈉抗凝后用Ficoll法分離出淋巴細胞，細胞重懸于RNA保護液并凍存于-80℃?zhèn)溆?。RNA的提取按照Qiagen公司的離心柱法。取1μg total RNA逆轉錄為cDNA，利用iRepertoire公司的HBHI-M的引物試劑盒對IGH重鏈區(qū)域進行兩步PCR擴增反應，第一步反應條件如下：50℃，40min；95℃，15min；94℃，30s，63℃，2min，72℃，30s，15cycle；94℃，30s，72℃，2min，10cycle；72℃，10min。第一步PCR結束后取2ul反應產(chǎn)物作為第二步PCR的模板，反應條件如下：95℃，15min；94℃，30s，72℃，90s，30cycle；72℃，5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測擴增效果并切下490-570bp大小的片段做膠回收，回收產(chǎn)物定量后用二代測序儀Miseq進行測序反應。

1.3 生物信息學分析

將測得的原始測序數(shù)據(jù)上傳到iRepertoire公司的網(wǎng)站由專業(yè)的生物信息人員進行統(tǒng)計分析，具體步驟包括：①去除掉數(shù)據(jù)中的冗余序列、短片段序列及測序質量差的序列；②將數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫IMGT(http://www.imgt.org/)進行比對查詢，根據(jù)IGH-CDR3區(qū)域V、J、D各區(qū)段的特點鑒定出各個樣本的CDR3肽段序列；③統(tǒng)計各樣本的免疫學特征。

2 結果

2.1 研究對象

5例研究對象病例信息見表1。5例樣本均成功地擴增出了外周血IGH-CDR3免疫組庫，各樣本中的CDR3數(shù)量和種類均不一致，變異范圍較大，經(jīng)分析未發(fā)現(xiàn)患者的臨床特征與CDR3數(shù)量和種類具有相關性(表1)。

2.2 IGH-V、-J基因家族的使用偏好性和其他免疫特征

通過與IMGT數(shù)據(jù)庫對比發(fā)現(xiàn)，5例子癇前期樣品有獨特的免疫學特性，且同一特性在各樣本間變異范圍較大，規(guī)律性較差(圖1)。具體為：CDR3區(qū)域的長度主要為39bp(14.42%)、48bp(11.42%)、45bp(10.58%)，分布對應于13、16、15個氨基酸(圖1-A)；N末端添加的堿基數(shù)從0到40bp呈高斯分布，頻率最高的堿基數(shù)分別為12(6.34%)、9(6.22%)、13(5.38%)、10(5.04%)、11(4.82%)(圖1-B)；J末端去除的堿基數(shù)主要是0(15.68%)、6(10.78%)、9(7.66%)、5(7.62%)、4(7.58%)(圖1-C)，而J基因使用頻率的順序為J4(43.52%)、J6(19.72%)、J3(19.66%)、J5(11.86%)、J1(3.56%)、J2(1.7%)(圖1-D)；V末端去除的堿基數(shù)主要是0(43.24%)、1(18.86%)、4(9.62%)、2(8.96%)(圖1-E)，而V基因區(qū)域本研究中共檢測到V1-7 7個家族共48個亞基因的使用情況，使用頻率的順序為V1-18(9.14%)、V3-23(9.1%)、V3-30-3(8.32%)、V3-30(7.62%)、V4-59(7.62%)(圖1-F)。

表1　5例子癇患者的病例信息

圖1子癇前期患者外周血IGH免疫學特征

2.3 各樣本表達頻率最高的10個IGH-CDR3肽段

IGH-CDR3序列是BCR分子與抗原結合的主要部分，決定了B細胞與抗原結合的特異性和強度，而外周血中存在的IGH-CDR3種類與數(shù)量又反映了個體的抗原接觸史和機體的免疫能力。通過與IMGT數(shù)據(jù)庫對比，本研究鑒定出了5例研究對象外周血中表達的IGH-CDR3肽段，范圍從118(樣本E)到6844(樣本C)種肽段(表1)，同時也發(fā)現(xiàn)5例均存在不同程度的特定IGH-CDR3克隆過度增殖的情況。例如樣本A中，雖然其全部的CDR3 read數(shù)目有4839個，但其中2031個拷貝(占全部41.97%)均表達ARDGEFFNDAFDL肽段，而其表達量最高的10個CDR3肽段占全部的CDR3總數(shù)的62.22%(3011/4839)。提示該患者的免疫系統(tǒng)正在清除某些抗原對機體的損害，尤其是與ARDGEFFNDAFDL序列結合的抗原的侵襲；樣本B中表達ATESPNTELDY肽段的拷貝數(shù)占全部CDR3 read的12.17%；樣本C中表達量最高的ARDKGTVCLDY拷貝數(shù)占全部CDR3 read的1.06%；樣本D中ARDRRKFTTGSGPDYYGMDA的拷貝數(shù)占全部的4.93%；樣本E中ARGLSGSRYEASDY的拷貝數(shù)占全部的12.33%(表2)。

表2　5例研究對象樣本中表達頻率最高的10個IGH-CDR3肽段

3 討論

B淋巴細胞主要介導機體體液免疫應答, 其通過細胞表面的BCR分子識別、結合抗原，產(chǎn)生特異性抗體，保護機體免受外界抗原的損害。在B細胞發(fā)育過程中，胚系DNA通過“Dn-Jn-Cn”基因重排形成CDR1、CDR2、CDR3三個高變區(qū)，而CDR3 區(qū)是多樣性最高的區(qū)域，也是決定B 細胞識別抗原肽的關鍵部位[11]。目前已知多種因素都可以影響CDR3的多樣性，包括重鏈、輕鏈的類型，重、輕鏈配對組合，N末端堿基的隨機插入，V、J末端核酸的去除，免疫球蛋白類型轉換及體細胞高頻突變等都能促成其多樣性形成[12]，所以據(jù)推測在生理狀態(tài)下B細胞IGH-CDR3多樣性可以達到1011種以上[13]，使得正常情況下機體幾乎能對所有侵入機體的異物產(chǎn)生應答[11]。所以通過分析B 細胞IGH-CDR3庫可以監(jiān)測和分析生理及病理狀態(tài)下機體的免疫狀況，對于了解疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療提供新思路、新方法。

本研究首次利用高通量測序技術對子癇前期患者外周血IGH-CDR3庫進行了篩查，并系統(tǒng)全面地闡述了其IGH-CDR3庫的免疫學特征。盡管已經(jīng)證實免疫失衡可以導致子癇前期的發(fā)生，但是在本研究中5例子癇前期患者IGH-CDR3庫仍存在較大的變異，CDR3 read數(shù)從1127到47386，二者相差47倍，而CDR3種類最高與最低的則相差58倍(6844/118)。另外體現(xiàn)IGH-CDR3多樣性的重要指標-CDR3 種類與CDR3 read數(shù)目的比值，在5例樣本中的變異也較大，最高值與最低值的比值為2.77(0.158/0.057)。表明子癇前期疾病雖然與體液免疫反應高度相關，但此期孕婦外周血中的IGH-CDR3數(shù)目與多樣性并沒有出現(xiàn)整體性偏移，仍存在非常高的多樣性。另外值得注意的是5例患者體內均出現(xiàn)個別克隆異常增殖的情況，拷貝數(shù)最高的克隆可以達到5768個，提示該患者的免疫系統(tǒng)正在清除體內可以與ATESPNTELDY肽段相結合的抗原的損害，同時也證明這5例患者的免疫系統(tǒng)處于活化的狀態(tài)。但是這5例患者表達量最高的10種CDR3肽段間卻沒有完全相同的序列，所以據(jù)此初步推測這5例患者體內沒有相同抗原和(或)致病原的存在。但是也不能排除另外一種可能性，即同一個外源蛋白經(jīng)抗原提呈作用后會產(chǎn)生多個序列不同、結合能力不等的抗原，機體針對同一外源蛋白的不同抗原則會產(chǎn)生相應不同的抗體(CDR3序列完全不同)，所以針對同一個外源蛋白，不同的人可能會有CDR3序列不同的抗體序列。同時，子癇前期患者IGH-CDR3仍然有一些特異的免疫學特性，正如本文中所呈現(xiàn)的那樣，包括CDR3區(qū)長度主要為13、16個氨基酸，N末端添加核苷酸數(shù)的頻率最高為12(6.34%)，V、J末端去除的堿基數(shù)主要是0(43.24%、15.68%)，J基因使用頻率最高的是J4(43.52%)，V基因使用頻率最高的前3個亞家族是V1-18(9.14%)、V3-23(9.1%)、V3-30-3(8.32%)。

綜上所述，本研究利用ARM-PCR擴增與高通量測序技術成功的展示了5例子癇前期患者IGH-CDR3序列的多樣性及免疫學特性，為全面揭示免疫失衡在子癇前期發(fā)病和治療中的作用提供了一定的基礎。

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[責任編輯：董琳]

The change on immunorepertoire of IGH CDR3 in peripheral blood of patients with preeclampsia

GUO Changlong1, YU Song2, WANG Qidi1, CAO Xiaofang1, YANG Ying1, CAI Ruikun1, AN Lisha1, DU Meng1, QIU Yue1, WANG Xingyu1,3, MA Xu1,*

1.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning,Beijing100081; 2.Beijingobstetricsandgynecologyhospital,Capitalmedicaluniversity.Beijingmaternalandchildhealthcarehospital; 3.BeijinginstituteofhypertensionleagueCorrespondingauthor:MAXu,Email:xjmagroup@163.com

AbstractObjective: To investigate the diversity and immunological characteristics of IGH CDR3 in peripheral blood of patients with preeclampsia. Methods: B lymphocyte was separated from peripheral blood of patients with preeclampsia, cDNA was reversed from RNA, and then IGH CDR3 region was amplified by ARM PCR. The corresponding PCR products were sequenced using the high throughput sequencing and blasted with the IMGT database. Results: There were difference on the number and species of IGH CDR3 in peripheral blood of five patients with preeclampsia, which range were from 1127 reads to 47385 reads; Patients with preeclampsia had unique immunological characteristics, which including IGH-CDR3 length, NT of N addition, usage bias of V and J gene, and NT of V and J removal; There was some abnormal proliferation of CDR3 peptides in peripheral blood of patients with preeclampsia. Conclusion: Immunorepertoire of IGH-CDR3 in peripheral blood of patients with preeclampsia has unique characteristics.

Key wordsPreeclampsia; Immunorepertoire; IGH-CDR3

基金項目：國家國際科技合作專項項目(2012DFB30130)、國家自然科學基金(81501418)

收稿日期：2016-02-02修回日期：2016-02-19

*通訊作者：xjmagroup@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.03