西安市第四醫(yī)院(西安 710004)

楊利萍　江　梅△　李　汀　樊英華　常遠(yuǎn)鴻　陰　俊　王曉玲　郭　佳　王君化

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肝脂肪酶基因-514C/T多態(tài)性與陜西地區(qū)非酒精性脂肪肝人群關(guān)系研究*

西安市第四醫(yī)院(西安 710004)

楊利萍江梅△李汀樊英華常遠(yuǎn)鴻陰俊王曉玲郭佳王君化

摘要目的：比較陜西地區(qū)人群中非酒精性脂肪肝(NAFLD)患者與正常人群肝脂肪酶(HLG)-514C/T多態(tài)性分布差異，探討其與NAFLD發(fā)病易感性關(guān)系。方法：選取NAFLD患者96例及正常對(duì)照組98例，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行基因多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)HLG-514位點(diǎn)基因型,并測(cè)量其體重指數(shù)、腰臀比、血壓、膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、空腹血糖指數(shù)。結(jié)果：正常對(duì)照組HLG-514 CC、CT、TT基因型分別是26.5%、59.2%、14.2%，NAFLD組31.3%、63.5%、5.2%，兩組CC基因型頻率和C等位基因頻率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：肝脂肪酶-514C/T以雜合子C/T基因型所占的百分比高，其基因多態(tài)性與陜西NAFLD患者發(fā)病有關(guān)。

主題詞非酒精性脂肪肝擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析多態(tài)現(xiàn)象，單核苷酸脂肪酶/分析

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與代謝綜合征、胰島素抵抗(Insulin resistance， IR)和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，疾病譜包括單純性脂肪肝(Simple fatty live，SFL)、脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis， NASH)及其相關(guān)肝硬化和肝細(xì)胞癌(Hepatocellular cellular,HCC)。NAFLD除直接或通過促進(jìn)并存的其他肝病進(jìn)展，導(dǎo)致肝功能衰竭、HCC和移植肝復(fù)發(fā)外，還參與2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病。其發(fā)病主要與胰島素抵抗和遺傳易感有關(guān)[1]。肝脂肪酶是肝臟特有的調(diào)節(jié)肝內(nèi)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，研究發(fā)現(xiàn)，肝脂肪酶基因(Hepatic lipase gene ,HLG)啟動(dòng)子區(qū)-514位點(diǎn)基因多態(tài)性與肝脂肪酶活性、血脂異常和IR相關(guān)[2]。本研究通過對(duì)比陜西地區(qū)NAFLD患者與健康人群中HLG-514位點(diǎn)基因型的分布情況，研究HLG-514位點(diǎn)不同基因型與NAFLD易感性的關(guān)系。

資料和方法

1一般資料選取2012年8月至2013年7月在陜西地區(qū)西安市第四醫(yī)院、安康市第一人民醫(yī)院、延安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院、門診及體檢中心經(jīng)臨床和影像學(xué)診斷為NAFLD的患者96例作為研究組，其中男性46例，女性50例，平均年齡45歲。另選取同期同地健康體檢者98例作為對(duì)照組，其中男性47例，女性51例，平均年齡44歲。兩組對(duì)象進(jìn)行問卷調(diào)查、體格檢查、血清學(xué)檢查和肝臟超聲檢查，進(jìn)行脂肪肝流行病學(xué)調(diào)查。NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》標(biāo)準(zhǔn)[3]。剔除標(biāo)準(zhǔn)包括：患各型病毒性肝炎、肝硬化、近期服用肝損害藥物及影響血脂代謝的藥物、惡性腫瘤等疾??；乙醇攝入量>40g/周或近2周內(nèi)有大量飲酒史；一級(jí)親屬中有2型糖尿病、高血壓、高脂血癥及其他代謝性疾病者。按性別、年齡、戶籍地配對(duì)選取相同數(shù)量正常人作為對(duì)照組。研究對(duì)象年齡、性別等一般資料與對(duì)照組健康志愿者相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2研究方法于清晨空腹?fàn)顟B(tài)行肝臟B超檢查、測(cè)量身高、體重、血壓、臀圍、腰圍。計(jì)算體重指數(shù)和腰臀比，采靜脈血10ml，其中5ml用于檢測(cè)空腹血糖、肝功、血脂及肝炎病毒血清學(xué)檢查，另5ml采用改進(jìn)的苯酚-氯仿提取方法提取基因組DNA，-20°C保存?zhèn)溆?，取DNA樣品2μl進(jìn)行瓊脂糖檢測(cè)符合要求。

2.1引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增：NCBI上確定位點(diǎn)序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成)，并進(jìn)行引物擴(kuò)增，選擇擴(kuò)增條帶單一、特異性好的引物進(jìn)行試驗(yàn)；上游引物5‘-CAGAGGGGGAAGAAGTGTGT-3’，下游引物5‘-GGTGATGCTTGTGGTCAAAG-3’，擴(kuò)增片段為139bp，梯度PCR擴(kuò)增后確定最佳退火溫度為61°C，94°C預(yù)變性5min，94°C變性50s，61°C退火40s，72°C延伸40s，72°C延伸10min，共34個(gè)循環(huán)。

2.2PCR產(chǎn)物檢測(cè)：取5μlPCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

2.3非變性聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行基因多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)：清洗玻板、膠條、烘干，將玻板固定，配制非變性聚丙烯酰胺凝膠，插入梳子，室溫下聚合2h左右，4°C冰箱放置過夜，凝膠聚合后，拔出梳齒，取PCR產(chǎn)物置于PCR管中，離心混勻，變形后冰浴，上樣，然后電泳，銀染聚丙烯酰胺凝膠，觀察結(jié)果并拍照保存。

2.4測(cè)序驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：根據(jù)非變性聚丙烯酰胺電泳及檢測(cè)結(jié)果選取HLG基因樣本，寄送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確定HLG-514基因型。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法等位基因頻率=(純合子例數(shù)X2+雜合子例數(shù))/(2X總例數(shù));統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Hardy-Weinberg定律、連鎖不平衡分析、等位基因頻率和基因型分布用計(jì)數(shù)資料表示。

結(jié)果

對(duì)194份DNA(98名健康對(duì)照、96例NAFLD患者)進(jìn)行基因型分析，發(fā)現(xiàn)在NAFLD與正常組中， TT基因型的分布頻率分別為5.2%和14.2%，CT基因型分布頻率分別為63.5%和59.2%， CC基因型分布頻率分別為31.3%和26.5%，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，兩組間等位基因頻率也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見附表。

附表　HLG-514基因多態(tài)性基因型

討論

國外研究認(rèn)為NAFLD的發(fā)病與個(gè)體及多種社會(huì)因素密切相關(guān)，不同種族、地域、體質(zhì)的人群發(fā)病的危險(xiǎn)因素各有特點(diǎn)，預(yù)防措施存在差異。近年來，隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，我國特別是城市地區(qū)的NAFLD的發(fā)病率明顯上升。盡管目前我國有一些NAFLD的流行病學(xué)調(diào)查，但絕大部分是基于特殊的職業(yè)人群或醫(yī)院，而針對(duì)普通人群的調(diào)查較少，僅見上海市有以普通城市人群相關(guān)NAFLD流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告，但仍缺乏對(duì)于陜西省城市地區(qū)普通人群NAFLD流行病學(xué)研究。

近年來，有研究認(rèn)為某些調(diào)節(jié)肝臟脂肪代謝的基因與NAFLD的發(fā)病及發(fā)展有著密切關(guān)系，相關(guān)基因的多態(tài)性與NAFLD的關(guān)系也有研究報(bào)道，但目前國內(nèi)都僅限于小樣本的研究，尚缺乏大樣本、多中心的研究。

Saibara等用PCR檢測(cè)95例NASH患者等位基因A2217G的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)G/G純合子組易出現(xiàn)肝細(xì)胞氣球樣變且年齡輕，提示遺傳因素參與NASH發(fā)病。國內(nèi)周永健[4-5]等研究發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞因子如脂聯(lián)素、過氧化物酶體增殖因子活化受體-γ(PPAR-γ)、 肝脂肪酶基因(Hepatic lipase gene，HLG)啟動(dòng)子區(qū)-514位點(diǎn)基因多態(tài)性與肝脂肪酶活性、血脂異常和IR相關(guān)、以及磷脂中磷脂酰膽堿磷脂酰乙醇胺N - 甲基轉(zhuǎn)移酶( PEMT)與NAFLD的發(fā)生與發(fā)展相關(guān)。

肝脂肪酶是由肝臟特異性合成并表達(dá)的調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)蛋白代謝的關(guān)鍵酶。肝脂肪酶選擇性分解脂蛋白中的甘油三酯和磷脂，還可與脂蛋白結(jié)合，參與脂蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[6]。其活性與內(nèi)臟脂肪含量呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)肝脂肪酶活性受多因素調(diào)控，其中HLG啟動(dòng)子區(qū)-514位點(diǎn)基因多態(tài)性與肝脂肪酶活性的關(guān)系密切，對(duì)細(xì)胞株的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HLG-514T變異可使HLG轉(zhuǎn)錄活性下降約30%，使肝脂肪酶活性降低[7]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，野生純合子(CC型)NAFLD發(fā)病的易感性明顯高于T等位基因攜帶者，HLG-514變異可令NAFLD發(fā)病易感性降低。對(duì)比不同種族間各基因型頻率和等位基因頻率的差異，發(fā)現(xiàn)華人與韓國人及美國黑種人T等位基因頻率接近，均高于美國白種人，這種基因分布的差異與美國黑人非酒精性脂肪肝發(fā)病率較白人低的情況一致[8-10]。

我們通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對(duì)98名正常人，96例NAFLD患者的HLG-514啟動(dòng)子區(qū)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性位點(diǎn)的CT基因型在NAFLD人群中(63.5%)高于正常對(duì)照組(59.2%)，CC基因型在NAFLD患者中(31.3%)高于健康對(duì)照者(26.5%)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HLG啟動(dòng)子區(qū)-514基因與陜西省NAFLD患者有關(guān)。但我們?cè)贜AFLD患者中進(jìn)行基因多態(tài)性的研究，僅對(duì)陜西省漢族人進(jìn)行了分析，樣本例數(shù)相對(duì)較少，對(duì)HLG-基因多態(tài)性與NAFLD發(fā)病的關(guān)系尚需大樣本、多地域、多民族廣泛深入?yún)f(xié)同研究。

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(收稿：2015-03-04)

Association of hepatic lipase gene promoter polymorphism -514C/T with nonalcoholic fatty liver disease of Shanxi

The No.4 Hospital of Xi’an( Xi’an710004)

Yang LipingJiang MeiLi Tinget al

ABSTRACTObjective: To study the prevalence of the hepatic lipase gene (LIPC) promoter polymorphism(at position -514)in patients of Shanxi with nonalcoholic fatty live disease(NAFLD)，and its relationship with the susceptibility to NAFLD. Methods: Genotype of LIPC promoter was detected with non-denaturant polyacrylamide gel electrophoresis in 96 patients with NAFLD and 98 of normal control．Body mass index，waist-to-hip ratio(WHR)，blood pressure, CHOL, HDL, LDL,TG and FPG of the patients were measured. Results: The proportions of genotypes of CC、CT and TT at -514 of LIPC in healthy people were26.5%、59.2%、14.2%，respectively, whereas those in patients with NAFLD were 31.3%、63.5%、5.2%, The frequency of CC genotype and C allele in the NAFLD group were significantly higher than those in the control group. Conclusion:The proportions of genotypes of C/T are dominant at -514 of LIPC in patients with NAFLD and controls. Gene polymorphism of LIPC-5 14C/T is correlated with susceptibility to NAFLD of Shanxi.

KEY WORDSNon-alcoholic fatty liver diseaseAmplified fragment length polymorphism analysisPolymorphism, single nucleotideLipase/analysis

【中圖分類號(hào)】R575.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.015

*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2011JM4036)

△通訊作者