延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安 716000)

劉曉斌　張正祥　吉金山　張欠欠　艾彩蓮　劉　燁△　惠起源△

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柴胡注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖及凋亡的影響*

延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院(延安 716000)

劉曉斌張正祥吉金山張欠欠艾彩蓮劉燁△惠起源△

摘要目的：探討柴胡注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床分子試驗(yàn)中心提供)分為空白對(duì)照組(加10%小牛血清的1640培養(yǎng)液)、氟尿嘧啶陽(yáng)性對(duì)照組(10μg/ml)及實(shí)驗(yàn)組(分別為5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml柴胡注射液)。采用噻唑藍(lán)比色法(即MTT)檢測(cè)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721對(duì)柴胡注射液藥物和氟尿嘧啶注射液的敏感性；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)柴胡注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞株(SMMC-7721細(xì)胞)周期的影響。結(jié)果：柴胡注射液對(duì)SMMC-7721的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，抑制率與柴胡注射液濃度呈正相關(guān)。不同濃度柴胡注射液處理肝癌細(xì)胞時(shí)，藥物濃度與凋亡細(xì)胞且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。結(jié)論：柴胡提取物可抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān)。

主題詞肝腫瘤，實(shí)驗(yàn)性細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡柴胡注射液

目前，對(duì)于中、晚期肝癌患者的治療，根據(jù)病情采用中醫(yī)中藥治療、放療、化療、冷凍、肝動(dòng)脈栓塞化療等多種方法, 但療效均不理想。研究表明,柴胡可通過(guò)保護(hù)肝細(xì)胞、殺傷或抑制細(xì)胞增殖的肝癌、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力以及逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞耐藥等發(fā)揮抗肝癌作用[1]。本研究以人肝癌SMMC-7721細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究柴胡注射液對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響，分析柴胡注射液對(duì)癌細(xì)胞周期的影響。

資料與方法

1 材料

1.1 細(xì)胞株：人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床分子試驗(yàn)中心提供。該細(xì)胞株在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中呈單層生長(zhǎng)，維持培養(yǎng)于37℃、5%CO2、95%空氣濕度的培養(yǎng)箱中。3～5d傳代一次，傳代時(shí)將原配養(yǎng)液吸出，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化1min，然后加入6ml新培養(yǎng)液終止消化，繼而用培養(yǎng)液吹打制成細(xì)胞懸液傳代或接種。

1.2試劑及主要儀器： 柴胡注射液由河南淅川制藥廠生產(chǎn)；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；胰蛋白酶干粉(批號(hào):810214)、酚紅(批號(hào): 831008)：上?；瘜W(xué)試劑廠生產(chǎn)；小牛血清：武漢三利生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；噻唑藍(lán)(MTT)、 二甲基亞砜(DMSO)：均購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；氟尿嘧啶注射液：北京北大藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(GMP)； 流式細(xì)胞儀(型號(hào):calber)：BD公司生產(chǎn)；酶聯(lián)檢測(cè)分析儀(型號(hào)-680)：美國(guó)伯樂(lè)。

2方法

2.1樣品液配制及實(shí)驗(yàn)分組

2.1.1小牛血清(100ml/瓶)：-20℃冰箱保存, 將小牛血清在56℃水浴中滅活(30min)后按1∶ 9的比例加入培養(yǎng)液，制成10%的小牛血清培養(yǎng)液。

2.1.2 0.25%胰蛋白酶溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取胰蛋白酶干粉0.25g，溶于RPMI 1640培養(yǎng)液中，稀釋至100ml，攪拌均勻后，保存于4℃冰箱，過(guò)夜后超凈臺(tái)抽濾除菌，取樣做無(wú)菌試驗(yàn)，然后-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3PBS干液(10×PBS，pH7.2)：KCl 0.2g，NaCl 9.0g， KH2PO40.27g，NaH2PO4·12H2O2.85g，雙蒸水100ml在振蕩器上充分混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4PBS工作液(1×PBS)：PBS干液50ml、雙蒸水450ml充分混勻分裝，103.4kPa(121.3℃)滅菌15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.5MTT液： PBS工作液配成5mg/ml過(guò)濾除菌，避光-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.6 柴胡注射液實(shí)驗(yàn)組：將柴胡注射液(每ml含生藥1g)溶于1640培養(yǎng)液中，分別制成5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml五組濃度梯度，并過(guò)濾除菌，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.7陽(yáng)性對(duì)照組：用滅菌生理鹽水將5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液稀釋成10μg/ml濃度，過(guò)濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.8陰性對(duì)照組：加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的完全培養(yǎng)液。

2.1.9 空白對(duì)照組：加入與實(shí)驗(yàn)組相同體積的完全培養(yǎng)液。

2.2 檢測(cè)方法與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法： 采用噻唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株對(duì)不同濃度柴胡注射液藥物和氟尿嘧啶注射液的敏感性，用流式細(xì)胞術(shù)( FCM) 檢測(cè)不同濃度柴胡注射液藥物和氟尿嘧啶注射液對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株周期的影響。運(yùn)用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，α=0.05(雙側(cè))作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)；計(jì)數(shù)資料應(yīng)用Fisher確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié)果

1柴胡注射液對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株增殖的抑制柴胡注射液可抑制SMMC-7721細(xì)胞，抑制率隨柴胡注射液濃度的升高而增加；其中，濃度為50mg/ml柴胡注射液組對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制率為49.82%，接近半數(shù)抑制率。柴胡注射液5mg/ml組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，25mg/ml柴胡注射液組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表1、2。

表1　柴胡注射液實(shí)驗(yàn)組、陰性、陽(yáng)性對(duì)照組及空白組OD值

表2　各組對(duì)SMMC-7721細(xì)胞活性及功能狀態(tài)影響

注：抑制率=(對(duì)照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%

2流式細(xì)胞儀檢測(cè)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721的細(xì)胞周期柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞作用12h后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示經(jīng)柴胡注射液作用后的的肝癌細(xì)胞株G1期細(xì)胞的百分比不斷減少,見(jiàn)表3。

3流式細(xì)胞儀檢測(cè)SMMC-7721細(xì)胞凋亡率未用藥時(shí)，凋亡細(xì)胞僅占2.32%，并且未出現(xiàn)凋亡峰。而當(dāng)用5mg/ml、10mg/ml、25mg/ml、50mg/ml柴胡注射液處理細(xì)胞12h后均出現(xiàn)了凋亡峰，凋亡細(xì)胞分別占總細(xì)胞數(shù)的13.62%、15.32%、23.32%、30.42%，隨著藥物濃度的增大凋亡率也增大，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

表3　不同濃度柴胡注射液對(duì)SMMC-7721

討論

茅敏等[2]通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得出小柴胡湯抗腫瘤的作用機(jī)制一方面可能與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)，另一方面可影響腫瘤細(xì)胞周期，造成其增殖指數(shù)降低，從而在一定程度上控制了腫瘤的增殖。喬喜婷等報(bào)道[3],柴胡主要活性成份柴胡皂苷具有對(duì)抗多種因素導(dǎo)致的肝損傷和肝纖維化的作用。細(xì)胞死亡是由正常的細(xì)胞周期改變而引起，細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，細(xì)胞阻滯于哪一期，凋亡就發(fā)生在哪一期。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，隨柴胡注射液劑量增加，G1期SMMC-7721細(xì)胞比率不斷減少，且呈劑量依賴(lài)性，而柴胡注射液對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制也呈劑量依賴(lài)性，表明柴胡注射液可能阻滯SMMC-7721細(xì)胞于G1期，并且通過(guò)誘導(dǎo)期凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤作用。

王艷麗等[4]的MTT法測(cè)定結(jié)果顯示：SSd(柴胡皂d)對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞株的增殖有明顯的抑制作用，隨著SSd作用濃度和時(shí)間的變化而改變，在一定的范圍內(nèi)呈明顯的劑量和時(shí)間依賴(lài)性。胡淑婷[5]等報(bào)道結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)研究顯示柴胡注射液處理SMMC-7721細(xì)胞株后，活細(xì)胞數(shù)目減少，癌細(xì)胞功能受抑制，抑制率隨濃度的升高而增加。當(dāng)柴胡注射液濃度為50mg/ml時(shí)，對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的抑制率(49.82%)接近半數(shù)抑制率；而且當(dāng)柴胡注液濃度達(dá)到25mg/ml時(shí), 其抑制率與氟尿嘧啶10μg/ml對(duì)照組的抑制率相差無(wú)幾，這一結(jié)果與唐婷婷[1]等報(bào)道結(jié)果相一致。

流式細(xì)胞術(shù)是近年來(lái)廣泛用于腫瘤細(xì)胞診斷及細(xì)胞動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域的新技術(shù)，它通過(guò)DNA含量分析細(xì)胞周期分布，從而反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)柴胡注射液作用后的肝癌細(xì)胞株G1期細(xì)胞的百分比不斷減少，說(shuō)明人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721主要被抑制在Gl期。同時(shí)顯示未用藥時(shí)，凋亡細(xì)胞僅占2.32%，并且未出現(xiàn)凋亡峰；而當(dāng)用不同濃度柴胡注射液處理細(xì)胞12h后均出現(xiàn)了凋亡峰，并且隨著藥物濃度的增大凋亡率也增大，呈劑量依賴(lài)關(guān)系。

可見(jiàn)，柴胡注射液中的有效成分可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。但不同學(xué)者報(bào)道的柴胡注射液對(duì)SMMC-7721的量效關(guān)系結(jié)果不完全相同，表明在肝癌的治療中運(yùn)用柴胡需足量，其制劑用于治療肝癌時(shí)則需對(duì)有效成分進(jìn)行精提取。

參考文獻(xiàn)

[1]唐婷婷, 施貝德.柴胡注射液抑制人肝癌細(xì)胞株HepG2增殖的實(shí)驗(yàn)研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2011,7(5):27-29.

[2]茅敏,付虹,黃秀深,等.小柴胡湯誘導(dǎo)荷瘤小鼠S180細(xì)胞凋亡及對(duì)細(xì)胞周期的影響[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,14(20):2646-2648.

[3]喬喜婷，王克窮，代引海，等.小柴胡湯聯(lián)合肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)治療原發(fā)性肝癌的臨床觀察[J].陜西中醫(yī)，2014，35(7)：835-836.

[4]王艷麗,和水祥,羅金燕,等.柴胡皂甙對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,27(6):572-574.

[5]胡淑婷,奧海航,王英華,等.小葉黑柴胡誘導(dǎo)人胃腺癌MGC-803細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,29(1):13-16.

(收稿：2015-03-23)

Effect of radix bupleuri injuction on hunman hepatic carcinoma cells' proliferation and apoptosis

The Medical College of Yan'an University(Yan'an 716000)

Liu XiaobinZhang Zhenxiang Ji Jinshanet al

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of bupleurum injection on human hepatic carcinoma cells'(SMMC-7721) apoptosis and related mechanisms. Methods: With different concentrations (0, 5, 10, 20, 25, 50mg/ml) treatment liver cancer SMMC-7721 cell line, determined by MTT method in different concentrations of tumor cells after treated by inhibiting rate; FCM detect different concentrations of radix bupleuri injection effect on SMMC-7721 cell cycle. Results: Different concentrations of radix bupleuri injection processing SMMC-7721 cell, number of living cells, cancer cells function inhibition, inhibition rate and radix bupleuri injection concentration were positively correlated, when the concentration of radix bupleuri injection of 50mg/ml, inhibition rate reached the maximum. Radix bupleuri injection 5mg/ml, 10mg/ml, 25mg/ml, 50mg/ml dealing with cells, apoptosis cells respectively accounted for 13.62%, 15.32%, 23.32%, 30.42% of the total, apoptosis rate increased with the increase of drug concentration, and a dose-response relationship. Conclusion: Bupleurum extract can inhibits human hepatic carcinoma SMMC-7721 cells' proliferation, induce its apoptosis, and the mechanism of action may be related to the regulation of cell cycle.

KEY WORDSLiver neoplasms,experimentalCell proliferationApoptosisChai hu zhu she ye

【中圖分類(lèi)號(hào)】R392.5

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.008

*陜西省教育廳專(zhuān)項(xiàng)科研基金項(xiàng)目(11JK0669)

△延安大學(xué)附屬醫(yī)院