蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所(蘇州215123)

徐英秀　肖蘊(yùn)祺　賈　佳▲

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緩釋硫化氫供體對小鼠腦缺血急性期保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)研究*

蘇州大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所(蘇州215123)

徐英秀肖蘊(yùn)祺賈佳▲

摘要目的：探討緩釋硫化氫緩釋供體對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法：采用線栓法建立小鼠局灶性腦缺血模型，將雄性 ICR 小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、溶劑對照組(Veh)和緩釋硫化氫緩釋供體ADT-OH 組。缺血再灌24h取腦組織，利用TTC染色法檢測小鼠腦梗死體積；通過實(shí)時(shí)定量 PCR (qPCR)檢測組織中炎癥因子。結(jié)果：TTC染色結(jié)果顯示，與Veh相比，ADT-OH能夠顯著降低腦缺血再灌注后大腦皮層、內(nèi)囊以及大腦半球的梗死體積；qPCR 結(jié)果顯示，與 Sham 組相比，Veh 組小鼠的缺血皮層組織中促炎因子iNOS、 IL-1β、TNF-α和IL-6 的表達(dá)水平明顯升高；與 Veh 相比，ADT-OH顯著降低促炎因子表達(dá)。結(jié)論：硫化氫緩釋供體對急性期腦缺血損傷具有一定的保護(hù)作用，機(jī)制可能與抑制腦缺血損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)。

主題詞硫化氫@供體腦缺血/病理生理學(xué)再灌注損傷炎癥介導(dǎo)素類小鼠

腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種類型，其中約 80%以上是缺血性腦卒中。缺血性腦卒中是因?yàn)槟X部動脈供血區(qū)的血流栓塞或出血而暫時(shí)或永久地減少導(dǎo)致的腦組織缺血。對于腦缺血的治療，目前唯一有效手段是在病發(fā)3h內(nèi)給予組織纖溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator, rtPA)，降低神經(jīng)功能損傷。然而，這種治療手段存在很大的風(fēng)險(xiǎn)，首先，rtPA有可能會造成患者腦出血。其次，大部分病人并不能在病發(fā)3h內(nèi)接受rtPA的治療。因此，對于此病的治療和預(yù)防各國都在積極研究尋找有效的藥物。

硫化氫(H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的氣體，一直被認(rèn)為是一種有害氣體，由血中進(jìn)入機(jī)體細(xì)胞后,硫化氫和細(xì)胞呼吸酶結(jié)合,并因此阻斷細(xì)胞內(nèi)呼吸，使中樞神經(jīng)細(xì)胞以及敏感的呼吸中樞細(xì)胞受損，同時(shí)硫化氫在短時(shí)間內(nèi)的濃度猛增會有致死作用。然而，上世紀(jì)80年代末人們檢測到在生理狀態(tài)下腦組織中存在一定量的H2S，并且對機(jī)體發(fā)揮重要作用。 H2S與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病都有著密切的關(guān)系，在肝臟等多種器官的缺血-再灌注損傷中具有保護(hù)作用[1-3]。但目前關(guān)于硫化氫供體在腦缺血模型中的研究較少。

最近，有研究表明H2S可以抑制LPS誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎癥[4]。然而在小鼠急性期腦缺血再灌注損傷時(shí)H2S如何發(fā)揮作用及其是否對炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。因此，本研究應(yīng)用小鼠腦缺血模型，分別觀察腦缺血損傷后給予H2S緩釋供體ADT-OH對腦組織中炎癥因子iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)的影響，從炎癥反應(yīng)角度探討H2S在小鼠急性期腦缺血中的作用。

資料與方法

1材料清潔級ICR小鼠(上海斯萊克公司)；5-對羥基苯基-1, 2-二硫雜環(huán)戊烯-3-硫酮(ADT-OH)(蘇州大學(xué)藥化實(shí)驗(yàn)室)；TTC(美國 Sigma 公司)；RNAiso Plus(寶生物工程有限公司)；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green I購自美國Invitrogen公司。

2方法

2.1小鼠局暫性大腦中動脈栓塞(tMCAO)模型建立：將小鼠腹腔注射水合氯醛(10g/ml)，使其完全麻醉；將小鼠固定在手術(shù)臺上腹部向上，在顯微鏡下，打開頸部，鈍性分離頜下腺，從小鼠右邊氣管處分離出頸總動脈，用縫合線輕微扎住。然后，繼續(xù)向頭部分離，分離到頸總動脈分叉處，將頸外動脈分離，用縫合線扎緊，電凝燒斷頸外動脈分支。同時(shí)扎緊頸總動脈。隨后，將頸外動脈用縫合線拉緊，在靠近結(jié)扎處，剪一小口，插入線拴，緩緩前進(jìn)至頸內(nèi)動脈并沿入顱骨方向推進(jìn)，同時(shí)觀察血流儀數(shù)值，當(dāng)數(shù)值突降約至基值30%，停止插栓，用縫合線將線拴系緊，然后將小鼠縫合。手術(shù)過程中，加熱燈保持溫度(37℃±0.5℃)。小鼠缺血1h后，拔出線栓，回復(fù)血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組不插入線栓，其余操作與手術(shù)組相同。

2.2實(shí)驗(yàn)分組：小鼠缺血再灌注3h后隨機(jī)分組，經(jīng)腹腔注射給予ADT-OH(50 mg/kg)或溶劑對照組(Veh )。再灌注24h取組織進(jìn)行TTC染色或檢測炎癥因子的表達(dá)。

2.3TTC染色：將小鼠脫臼處死，小心取出完整的腦，并將腦切成 2 mm厚的切片，置于 1%的 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)中，37℃恒溫水浴，5 min后，去除 TTC 染色劑，并用干凈的吸水紙吸取腦切片表面的水分。將染好腦片倒入10%的多聚甲醛溶液，淹沒切片為宜，固定 24 h后，拍取照片，用圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)分析梗死體積(正常腦組織染為紅色，梗死腦組織染為白色)。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, qPCR)：于-80℃取出腦組織樣本，立即加入適量RNAiso Plus(根據(jù)組織大小估量)，用研磨棒快速反復(fù)研磨勻漿，室溫靜置 5min，移至高速冷凍離心機(jī)，配平，4℃ 12000rPm 離心 5min，謹(jǐn)慎吸取上清液，移入新 1.5ml EP 管中(切勿吸取沉淀)，按照RNA抽提試劑盒的操作提取總RNA，采用NanoDrop檢測RNA含量，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明于 PCR儀上反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA(25℃ 10min，37℃ 120min，85℃ 5s，4℃ ∞)。在ABI 7500 PCR 儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行溶解曲線觀察分析非特異性擴(kuò)增和引物二聚體是否存在，Ct 值用 2∧-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)量差異，以 18S 為參照基因。引物序列見表1。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩獨(dú)立組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間用one-way Anova檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　引物序列表

結(jié)果

1ADT-OH 處理減少缺血后的腦梗死體積缺血再灌注 3 h后給予ADT-OH(50mg/kg)處理，再灌注 24 h后收取腦組織，進(jìn)行 TTC 染色(圖1)，結(jié)果與溶劑對照組(Veh)相比，ADT-OH處理組(ADT-OH)梗死體積明顯減少。溶劑對照組(Veh)皮層、內(nèi)囊、半球梗死體積分別為 66.0±6.9%、64.0±25.2%、60.0±9.3%；ADT-OH組皮層、內(nèi)囊、半球梗死體積分別為38.5±12.8%、35.1±5.6%、31.0±8.5%。結(jié)果顯示(圖2)：ADT-OH 可明顯降低皮層、內(nèi)囊和半球的梗死體積(*P<0.05);與溶劑對照組(Veh)相比，ADT-OH處理組(ADT-OH)的皮層、內(nèi)囊和半球的梗死體積百分率明顯降低(*P<0.05)。

2ADT-OH 明顯降低腦缺血后皮層組織中促炎因子的表達(dá)已有文獻(xiàn)表明急性期腦缺血再灌注損傷會誘導(dǎo)大量促炎癥因子釋放，進(jìn)一步加劇腦組織損傷，而促炎因子iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6都被證明與腦缺血中腦組織損傷相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過Real-time PCR檢測iNOS、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA水平，驗(yàn)證是否ADT-OH對腦缺血損傷的保護(hù)作用是通過抑制上述促炎因子表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)中我們造小鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)，小鼠缺血再灌注3h通過腹腔注射ADT-OH和Veh(對照)，再灌注24h提取RNA。結(jié)果顯示(圖3)：與假手術(shù)(sham)組相比，Veh 組小鼠的缺血皮層組腦組織中促炎因子(iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6)的表達(dá)顯著升高(*P< 0.05，**P<0.01)，與注射veh的缺血側(cè)相比， ADT-OH組缺血側(cè)促炎因子表達(dá)明顯降低(*P< 0.05，**P<0.01)。提示在小鼠腦缺血模型中ADT-OH能夠抑制腦缺血再灌注引起的中樞神經(jīng)炎癥 。

討論

硫化氫和NO、CO同屬于“氣體遞質(zhì)”家族，它在不同組織和器官中都具有重要的生理作用，H2S能影響神經(jīng)突觸傳遞，增強(qiáng)海馬長時(shí)程記憶，并影響膠質(zhì)細(xì)胞和周圍細(xì)胞的信號傳遞，氧化應(yīng)激而產(chǎn)生的內(nèi)源性H2S還具有重要的抗氧化功能。H2S對于調(diào)節(jié)神經(jīng)功能活性，抵制大腦缺血性損傷都有一定作用。然而，硫化氫在腦卒中方面的研究卻一直存在爭議，有文獻(xiàn)報(bào)道在全腦大鼠腦缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注12h大鼠前腦皮質(zhì)組織中H2S含量顯著升高，而再灌注24h檢測H2S含量明顯下降[5]，腦缺血早期(12h)產(chǎn)生較高水平的H2S，其原因可能是機(jī)體對神經(jīng)元興奮性作出的一種反應(yīng)。再灌注24h大鼠腦組織H2S水平出現(xiàn)下降可能與H2S發(fā)揮清除自由基抗氧化等消耗有關(guān)。Ren[6]等在腦缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)當(dāng)給予25μmol/kg NaHS可抑制腦缺血引起的神經(jīng)元損傷，而當(dāng)給予180μmol/kg NaHS則加劇神經(jīng)元損傷。究其原因，可能主要是在此研究中采用的是無機(jī)硫化氫供體NaHS，低濃度的無機(jī)供體是有神經(jīng)保護(hù)作用的，但如果無機(jī)供體迅速釋放大量的硫化氫則會產(chǎn)生神經(jīng)毒性[7]。有機(jī)的硫化氫供體，可以緩慢且持久的釋放硫化氫，其效果更優(yōu)于普通的無機(jī)硫化氫供體。因此，在本研究中我們利用緩釋硫化氫供體(ADT-OH),在小鼠腦缺血再灌注3h腹腔注射ADT-OH(50mg/kg)緩慢釋放H2S，使腦內(nèi)硫化氫含量維持正常的生理水平，再灌注24h收取腦組織。結(jié)果顯示，ADT-OH能夠降低腦缺血再灌注引起的皮層、內(nèi)囊以及半球的梗死體積。qPCR檢測顯示，ADT-OH明顯降低缺血側(cè)促炎因子(iNOS /IL-1β、TNF-α、IL-6)的表達(dá)，進(jìn)而抑制中樞神經(jīng)炎癥。

本研究表明，ADT-OH能夠降低腦缺血再灌注后腦梗死體積，對腦缺血急性期損傷具有一定保護(hù)作用。ADT-OH能夠抑制腦缺血后急性期促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制中樞神經(jīng)炎癥，但具體機(jī)制尚不明確有待深入研究。這些結(jié)果提示硫化氫緩釋供體可能通過抑制中樞神經(jīng)炎癥發(fā)揮對急性期腦缺血損傷的保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

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(收稿：2015-06-02)

The Protective effects of a slow-releasing hydrogen sulfide donor to mice acute ischemia

Institute of Neuroscience, Suzhou University (Suzhou 215123)

Xu YingxiuXiao YunqiJia Jia

ABSTRACTObjective: To investigate the effects of the slow-releasing hydrogen sulfide donor ADT-OH in mice cerebral ischemic reperfusion injury. Methods: The mice focal cerebral ischemia model was found through MCAO and the male ICR mice were randomly divided into Sham, Veh, and slow-releasing hydrogen sulfide donor ADT-OH group. After 24 hours' ischemic reperfusion, the brain tissue was got out and the mice's brain infarct volumes were assessed with triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. The expression of inflammatory factors in tissue was detected by qPCR. Results: The TTC manifested that compared to Veh, the ADT-OH could significantly reduce the cerebral infarct volume of the pallium, internal capsule and cerebral hemisphere after the ischemic reperfusion. The qPCR shown that compared to Sham, the expression level of proinflammatory factors like iNOS, IL-1β, TNF-α and IL-6 in the ischemic cortex in Veh was significantly increased; while compared to Veh, ADT-OH reduced the expression of proinflammatory factors significantly. Conclusion: ADT-OH exerted protective effects to acute cerebral ischemic reperfusion injury. The underlying mechanism may be related to the inflammatory reaction which induced by the inhibition of cerebral ischemia.

KEY WORDSHydrogen sulfide@DonorsBrain ischemia/physiopathologyReperfusion injuryInlammation mediatorsMice

通訊作者：▲蘇州大學(xué)藥學(xué)院

【中圖分類號】R363

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.03.001

·論著·基礎(chǔ)研究·

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81371278)