陳 靜，陳 磊，吳孟超，石曉禎

·論著·

乙型肝炎病毒X蛋白相關(guān)微小RNA差異表達(dá)在乙型肝炎病毒復(fù)制中的作用研究

陳 靜，陳 磊，吳孟超，石曉禎

200437上海市締達(dá)生物科技有限公司(陳靜，石曉禎)；第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院(陳磊，吳孟超)；國(guó)際合作信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室(陳磊)

【摘要】背景乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)在乙型肝炎病毒復(fù)制及肝癌形成中扮演著重要的角色。研究HBX相關(guān)微小RNA(miRNAs)的差異表達(dá)有可能為調(diào)控乙型肝炎病毒復(fù)制、闡明肝癌發(fā)展進(jìn)程及開(kāi)展預(yù)后干預(yù)提供重要信息。目的探討肝癌細(xì)胞中HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)及其在乙型肝炎病毒復(fù)制中的作用。方法選取2014年1—10月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院收治的13例肝癌患者的肝癌組織及距離肝癌組織>2 cm癌旁組織的新鮮石蠟包埋標(biāo)本，采用微陣列技術(shù)分析HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法定量分析肝癌組織與癌旁組織中7個(gè)與肝臟功能相關(guān)的miRNAs及HBX mRNA表達(dá)水平，同時(shí)分析過(guò)表達(dá)hsa-miR-373或抑制hsa-miR-22對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響。結(jié)果微陣列技術(shù)分析顯示，HepG2-X細(xì)胞系和HepG2-CAT細(xì)胞系中有46種miRNAs差異表達(dá)，與HepG2-CAT細(xì)胞系相比，HepG2-X細(xì)胞系中20種miRNAs表達(dá)上調(diào)，26種miRNAs表達(dá)下調(diào)。肝癌組織與癌旁組織中hsa-miR-22、hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155及HBX mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組織與癌旁組織中hsa-miR-181a、hsa-miR-34a、hsa-let-7i表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，hsa-miR-22表達(dá)水平與HBX mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.415，P=0.018)，hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155表達(dá)水平與HBX mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.322，P=0.043；r=-0.369，P=0.028；r=-0.426，P=0.016)；hsa-miR-181a、hsa-miR-34a、hsa-let-7i表達(dá)水平與HBX mRNA表達(dá)水平無(wú)直線相關(guān)關(guān)系(r=0.076，P=0.363；r=0.017，P=0.676；r=0.122，P=0.242)。第2天和第3天hsa-miR-22抑制劑組、hsa-miR-373前體組HepG2.2.15細(xì)胞系及HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較陰性對(duì)照組降低(P<0.05)；第2天和第3天hsa-miR-373前體組HepG2.2.15細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較hsa-miR-22抑制劑組降低(P<0.05)。第2天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較hsa-miR-22抑制劑組升高，第3天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較hsa-miR-22抑制劑組降低(P<0.05)。第2天和第3天hsa-miR-373前體組HepG 2.2.15細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝抑制率較hsa-miR-22抑制劑組升高(P<0.05)。第2天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝抑制率較hsa-miR-22抑制劑組降低，第3天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝抑制率較hsa-miR-22抑制劑組升高(P<0.05)。結(jié)論HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)可通過(guò)靶向相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響乙型肝炎病毒在肝癌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

【關(guān)鍵詞】肝腫瘤；乙型肝炎病毒X蛋白；微小RNA；病毒復(fù)制

陳靜，陳磊，吳孟超，等.乙型肝炎病毒X蛋白相關(guān)微小RNA差異表達(dá)在乙型肝炎病毒復(fù)制中的作用研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2016，19(15)：1786-1791.[www.chinagp.net]

Chen J,Chen L,Wu MC,et al.Effect of differential expression of HBX-regulated miRNAs on HBV replication[J].Chinese General Practice，2016，19(15)：1786-1791.

微小RNA(microRNA，miRNAs)是一類長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸分子的小RNA，在動(dòng)、植物體內(nèi)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡過(guò)程中扮演重要的角色[1-2]。研究miRNAs差異表達(dá)、miRNAs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其對(duì)細(xì)胞功能的影響，對(duì)病毒感染以及腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要意義[3]。肝癌是一個(gè)全球健康問(wèn)題，肝癌的發(fā)生發(fā)展與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染密切相關(guān)[4]。乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)是乙型肝炎病毒基因組HBX基因編碼的蛋白，是一種反式激活因子，參與乙型肝炎病毒復(fù)制及肝癌進(jìn)展[5]。因此，鑒別HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)及其潛藏的生物學(xué)功能，對(duì)研究肝癌形成、針對(duì)關(guān)鍵miRNAs開(kāi)展干預(yù)治療以及調(diào)控乙型肝炎病毒復(fù)制具有重要的臨床意義[6]。本研究利用微陣列技術(shù)分析肝癌細(xì)胞系，采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法分析肝癌細(xì)胞中HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)，并研究了過(guò)表達(dá)hsa-miR-373或抑制hsa-miR-22對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響。

1材料與方法

1.1標(biāo)本選取2014年1—10月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院收治的慢性乙型肝炎致肝癌患者13例為研究對(duì)象，其中男8例，女5例；年齡35～56歲，平均年齡(43.2±7.2)歲；慢性乙型肝炎病史10年以上，無(wú)其他臟器合并癥。收集肝癌患者肝癌組織及距離肝癌組織>2 cm癌旁組織的新鮮石蠟包埋標(biāo)本。

1.2細(xì)胞系HepG2-X細(xì)胞系(為穩(wěn)定表達(dá)HBX的細(xì)胞系)、HepG2-CAT細(xì)胞系〔為穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因——細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)的細(xì)胞系〕及HepAD-38細(xì)胞系[7]由美國(guó)托馬斯杰斐遜大學(xué)Mark A Feitelson教授惠贈(zèng)，穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)[5]。HepG2.2.15細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，并按已報(bào)道流程培養(yǎng)[8]。

1.3試劑miRVana miRNA Isolation Kit、miRNA Negative control #1、hsa-miR-373 前體和anti-miR-22購(gòu)自Ambion(美國(guó))；Qiagen Blood Kit購(gòu)自Qiagen(德國(guó))；hsa-miR-22、hsa-miR-181a、hsa-miR-34a、hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155、hsa-let-7i和U6的RT-qPCR和 PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4HBX免疫組織化學(xué)染色切割新鮮石蠟包埋標(biāo)本并根據(jù)文獻(xiàn)[9]提供的實(shí)驗(yàn)流程用兔抗人anti-HBX抗體x-99多克隆抗體(由國(guó)際合作信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室制備)進(jìn)行HBX染色。所有肝癌組織及癌旁組織先用10%甲醛溶液固定，然后脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片(5 μm厚)，切片脫蠟、水合，并在枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸修復(fù)抗原。1%牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉30 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜后滴加二抗DAKO，37 ℃孵育45 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色(DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，蘇木素復(fù)染。在顯微鏡下觀察肝癌組織及癌旁組織切片中HBX的染色強(qiáng)度。所有染色步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5miRNAs及總RNA分離按miRVana miRNA Isolation Kit的流程抽提HepG2-X細(xì)胞系、HepG2-CAT細(xì)胞系及13對(duì)新鮮肝癌組織/癌旁組織標(biāo)本中的miRNAs。將細(xì)胞懸液或組織勻漿用試劑盒中的Lysis/Binding Buffer裂解，劇烈震蕩以破解細(xì)胞釋放miRNAs；加入1/10體積的miRNA Homogenate Additive蝸旋震蕩后冰浴，加入和Lysis/Binding Buffer等體積的苯酚和三氯甲烷溶液,混勻后10 000×g離心5 min，取上層水相與1/3體積的100%乙醇溶液充分混合后，加到結(jié)合柱中，10 000×g離心15 s，收集濾液，再添加2/3濾液體積的室溫100%乙醇溶液混勻，加入一個(gè)新的結(jié)合柱中，10 000×g離心15 s后棄去濾液，用miRNA Wash Solution 1、2、3各洗滌1次，最后用95 ℃預(yù)熱的無(wú)RNA酶水或者Elution Solution洗脫。按總RNA抽提液TRIZOL Reagent(Invitrogen，美國(guó))的流程抽提13對(duì)新鮮肝癌組織/癌旁組織標(biāo)本中的總mRNA。將組織勻漿用TRIZOL Reagent裂解，加入三氯甲烷溶液混勻，10 000×g離心5 min后吸取上層含有總RNA的水相置入新EP管，加入異丙醇沉淀總RNA，20 000×g離心15 min用75%乙醇洗滌總RNA沉淀，晾干后用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。提純后的miRNAs及總RNA測(cè)定260 nm/280 nm處的吸光度，-80 ℃保存。

本研究要點(diǎn)：

(1)本研究采用微陣列技術(shù)分析肝癌細(xì)胞中乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)相關(guān)微小RNA(miRNAs)的差異表達(dá)，并初步分析了其中部分miRNAs在乙型肝炎病毒復(fù)制中的作用。

(2)本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌細(xì)胞中有46種miRNAs受HBX 影響，其中有20種miRNAs表達(dá)上調(diào)，26種miRNAs表達(dá)下調(diào)。

(3)7種可能參與乙型肝炎病毒復(fù)制或肝癌發(fā)生的miRNAs中，hsa-miR-22、hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155表達(dá)水平在肝癌組織與癌旁組織中有差異，同時(shí)hsa-miR-22表達(dá)水平與HBX mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155表達(dá)水平與HBX mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

(4)過(guò)表達(dá)hsa-miR-373或抑制hsa-miR-22可顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞系和HepAD-38細(xì)胞系中乙型肝炎病毒的復(fù)制。

1.6微陣列技術(shù)分析HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)HepG2-X細(xì)胞系和HepG2-CAT細(xì)胞系中抽提得到RNA樣品各50 μl，進(jìn)行配對(duì)miRNAs微陣列技術(shù)分析(LC Sciences，美國(guó)),計(jì)算HepG2-X/HepG2-CAT，確定差異表達(dá)倍數(shù)進(jìn)行排序。

1.7RT-qPCR法定量分析miRNAs及HBX mRNA表達(dá)水平采用RT-qPCR法分析肝癌組織/癌旁組織中miRNAs及HBX mRNA表達(dá)水平。基于文獻(xiàn)[10]，選取7個(gè)與肝臟功能相關(guān)的miRNAs，包括3個(gè)在HepG2-X細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)的miRNAs(hsa-miR-22、hsa-miR-181a、hsa-miR-34a)和4個(gè)在HepG2-X細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)的miRNAs(hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155、hsa-let-7i)。檢測(cè)miRNAs時(shí)每個(gè)RT-qPCR體系中將25 ng miRNAs、miRNA反轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、5×RT buffer、RNasin、MMLV酶、DEPC水混合，37 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min后，85 ℃熱滅活5 min；隨后加入miRNAs qPCR引物及FastStart Universal SYBR Green Master mix(Rox)(ROCHE，德國(guó))，采用ABI 7500 Real-Time定量PCR儀(ABI，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，PCR程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；以U6作為內(nèi)參。檢測(cè)HBX mRNA表達(dá)水平時(shí)每個(gè)RT-qPCR體系中將100 ng mRNA、反轉(zhuǎn)錄6nt隨機(jī)引物、dNTPs、5×RT buffer、RNasin、MMLV酶、DEPC水混合，37 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min后，85 ℃熱滅活5 min；隨后加入HBX mRNA qPCR引物及FastStart Universal SYBR Green Master mix(Rox)，采用ABI 7500 Real-Time定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，PCR程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；以18s rRNA作為內(nèi)參。miRNAs表達(dá)水平用miRNAs與內(nèi)參U6 Ct值的差值ΔCtmiRNAs〔ΔCtmiRNAs=-(CtmiRNAs-CtU6)〕表示；HBX mRNA表達(dá)水平用HBX mRNA與內(nèi)參18s rRNA Ct值的差值ΔCtHBX mRNA〔ΔCtHBX mRNA=-(CtHBX mRNA-Ct18s rRNA)〕表示。

2結(jié)果

2.1HBX調(diào)控的miRNAs差異表達(dá)微陣列技術(shù)分析顯示，HepG2-X細(xì)胞系和HepG2-CAT細(xì)胞系中有46種miRNAs差異表達(dá)，與HepG2-CAT細(xì)胞系相比，HepG2-X細(xì)胞系中20種miRNAs表達(dá)上調(diào)，26種miRNAs表達(dá)下調(diào)(見(jiàn)表1、圖1)。

2.2RT-qPCR法定量分析miRNAs及HBXmRNA表達(dá)水平肝癌組織與癌旁組織中hsa-miR-22、hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155及HBXmRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肝癌組織與癌旁組織中hsa-miR-181a、hsa-miR-34a、hsa-let-7i表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

2.3相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，hsa-miR-22表達(dá)水平與HBXmRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.415，P=0.018)，hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155表達(dá)水平與HBXmRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.322，P=0.043；r=-0.369，P=0.028；r=-0.426，P=0.016)；hsa-miR-181a、hsa-miR-34a、hsa-let-7i表達(dá)水平與HBXmRNA表達(dá)水平無(wú)直線相關(guān)關(guān)系(r=0.076，P=0.363；r=0.017，P=0.676；r=0.122，P=0.242)。

注：miRNAs=微小RNA

圖1　HBX調(diào)控的miRNAs差異表達(dá)微陣列技術(shù)分析圖

表1HBX相關(guān)miRNAs差異表達(dá)微陣列技術(shù)分析結(jié)果

Table 1Differentially expressed HBX-related miRNAs by microarray analysis

編號(hào)探針標(biāo)識(shí)HepG2-X細(xì)胞系HepG2-CAT細(xì)胞系HepG2-X/HepG2-CATHepG2-X細(xì)胞系中miRNAs表達(dá)上調(diào) 1hsa-miR-542-5p412.654.67-6.21 2hsa-miR-222091.08814.17-1.30 3hsa-miR-6631252.37559.82-1.15 4hsa-miR-63814865.087188.07-1.05 5hsa-miR-575371.21195.98-0.95 6hsa-miR-181a2162.731084.31-0.90 7hsa-miR-5741054.20656.37-0.72 8hsa-miR-148a847.00515.70-0.69 9hsa-miR-99b803.62517.24-0.64 10hsa-miR-34a2287.221593.84-0.55 11hsa-miR-425-5p1531.641048.80-0.55 12hsa-miR-146a1573.181092.16-0.52 13hsa-miR-181b2302.841565.25-0.50 14hsa-miR-10310746.357735.30-0.46 15hsa-miR-1079513.037142.21-0.44 16hsa-miR-2223486.072660.43-0.43 17hsa-miR-2410474.498423.06-0.36 18hsa-miR-19110090.308037.62-0.34 19hsa-miR-935534.524334.91-0.33 20hsa-miR-2158338.6048732.69-0.26HepG2-X細(xì)胞系中miRNAs表達(dá)下調(diào) 1hsa-miR-37336.34184.872.24 2hsa-miR-422b96.69399.792.07 3hsa-miR-7112.72391.411.80 4hsa-miR-30e-3p39.01122.551.69 5hsa-miR-365133.18353.571.38 6hsa-let-7i179.62472.251.36 7hsa-miR-15555.96125.521.29 8hsa-let-7g1232.012950.181.08 9hsa-miR-454-3p625.461180.561.00 10hsa-let-7d487.32915.180.90 11hsa-let-7c438.03768.580.84 12hsa-let-7f1471.042924.930.74 13hsa-miR-148b768.371204.550.69 14hsa-miR-15b3203.725179.950.68 15hsa-miR-15a476.88790.580.68 16hsa-miR-146b975.771552.230.67 17hsa-miR-92b4883.127353.030.51 18hsa-miR-5942168.712918.820.42 19hsa-miR-2157817.8110169.990.42 20hsa-miR-4832011.732654.540.41 21hsa-let-7a2700.143681.230.41 22hsa-miR-20b8008.7110597.250.38 23hsa-miR-9211881.0514904.740.32 24hsa-miR-26b11502.1613990.540.28 25hsa-miR-27b10394.6612018.330.21 26hsa-miR-23a14559.3416142.120.18

注：miRNAs=微小RNA

2.4過(guò)表達(dá)hsa-miR-373或抑制hsa-miR-22對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的影響第2天和第3天陰性對(duì)照組、hsa-miR-22抑制劑組、hsa-miR-373前體組HepG2.2.15細(xì)胞系及HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中第2天和第3天hsa-miR-22抑制劑組、hsa-miR-373前體組HepG2.2.15細(xì)胞系及HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第2天和第3天hsa-miR-373前體組HepG2.2.15細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較hsa-miR-22抑制劑組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第2天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較hsa-miR-22抑制劑組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第3天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝數(shù)較hsa-miR-22抑制劑組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3)。

第2天和第3天hsa-miR-373前體組HepG2.2.15細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝抑制率較hsa-miR-22抑制劑組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第2天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝抑制率較hsa-miR-22抑制劑組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第3天hsa-miR-373前體組HepAD-38細(xì)胞系乙型肝炎病毒拷貝抑制率較hsa-miR-22抑制劑組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表4)。

3討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)約有3億慢性乙型肝炎病毒感染的患者，慢性乙型肝炎誘發(fā)的肝硬化是肝癌發(fā)生的主要病因之一[4,11]。而其中乙型肝炎病毒編碼的HBX則是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素[12]。因此，研究HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)將加深對(duì)乙型肝炎病毒慢性感染誘發(fā)肝癌過(guò)程中復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為干預(yù)肝癌進(jìn)展、抗腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供新方法、新思路。

Table 3Comparison of HBV replication number of HepG2.2.15 and HepAD-38 cell lines among negative control group,hsa-miR-22 inhibition group and hsa-miR-373 precursor group

組別HepG2.2.15細(xì)胞系第2天 第3天HepAD-38細(xì)胞系第2天 第3天陰性對(duì)照組0.87±0.011.27±0.0265.5±1.072.1±1.8hsa-miR-22抑制劑組0.81±0.01a1.14±0.02a40.2±0.1a58.3±1.4ahsa-miR-373前體組0.68±0.01ab1.01±0.03ab49.8±1.0ab53.4±2.0abF值378.81133.74701.0489.14P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：與陰性對(duì)照組比較，aP<0.05；與hsa-miR-22抑制劑組比較，bP<0.05

Table 4Comparison of HBV replication inhibition rate of HepG2.2.15 and HepAD-38 cell lines between hsa-miR-22 inhibition group and hsa-miR-373 precursor group

組別HepG2.2.15細(xì)胞系第2天 第3天HepAD-38細(xì)胞系第2天 第3天hsa-miR-22抑制劑組6.7±0.910.2±1.238.6±0.219.0±1.9hsa-miR-373前體組21.4±0.920.7±2.123.9±1.626.8±2.8t值-20.579-7.59915.957-3.404P值<0.0010.002<0.0010.027

本研究利用微陣列技術(shù)分析穩(wěn)定表達(dá)HBX的HepG2-X細(xì)胞系及其對(duì)照HepG2-CAT細(xì)胞系中miRNAs差異表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)46種受HBX調(diào)控的miRNAs。隨后，對(duì)與肝臟功能相關(guān)的候選的7個(gè)差異表達(dá)miRNAs，在13對(duì)肝癌組織及癌旁組織中進(jìn)行了檢測(cè)，并與HBX表達(dá)情況進(jìn)行了對(duì)比，其中有4個(gè)miRNAs(hsa-miR-22、hsa-miR-373、hsa-miR-92、hsa-miR-155)與HBX mRNA表達(dá)水平相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)引入has-miR-373 前體或has-miR-22抑制劑后HepG2.2.15細(xì)胞系(產(chǎn)生低拷貝乙型肝炎病毒)和 HepAD-38細(xì)胞系(產(chǎn)生高拷貝乙型肝炎病毒)中乙型肝炎病毒的復(fù)制水平均被顯著抑制。

上述結(jié)果提示，HBX可通過(guò)調(diào)控miRNAs的表達(dá)，在乙型肝炎病毒復(fù)制中扮演著非常重要的角色。由于HBX可作為反式激活因子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，因此推測(cè)HBX有可能通過(guò)與不同的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合從而分別實(shí)現(xiàn)抑制has-miR-373的表達(dá)和促進(jìn)has-miR-22的表達(dá)。同時(shí)由于不同miRNAs可通過(guò)不完全互補(bǔ)配對(duì)方式與基因轉(zhuǎn)錄本3′非翻譯區(qū)結(jié)合從而抑制基因的表達(dá)，因此本研究推測(cè)HBX可通過(guò)調(diào)控has-miR-373和has-miR-22的表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié)不同下游基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的精細(xì)調(diào)控。

綜上所述，HBX相關(guān)miRNAs的差異表達(dá)可通過(guò)靶向相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有效影響乙型肝炎病毒在肝癌細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。對(duì)于發(fā)現(xiàn)的顯著影響乙型肝炎病毒復(fù)制的has-miR-373和has-miR-22是如何通過(guò)干預(yù)不同基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)乙型肝炎病毒復(fù)制的調(diào)控以及其介導(dǎo)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間是否存在交互調(diào)控尚需后續(xù)深入研究。

作者貢獻(xiàn)：陳靜提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施和數(shù)據(jù)分析，撰寫(xiě)論文；陳磊完善研究方案，采集樣本，數(shù)據(jù)分析復(fù)核，修改論文；吳孟超負(fù)責(zé)最終版本修訂；石曉禎協(xié)助采集樣本并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of Differential Expression of HBX-regulated miRNAs on HBV Replication

CHENJing,CHENLei,WUMeng-chao,etal.

ShanghaiDIDABiotechnologyCo.,Ltd,Shanghai200437,China

【Abstract】BackgroundHepatitis B virus X protein(HBX) plays a very important role in HBV replication and hepatocarcinogenesis(HCC).Research on the differential expression of HBX-regulated miRNAs may provide important information for the regulation of HBV replication,the elaboration of the development process of liver cancer and intervention on prognosis.ObjectiveTo explore the differential expression of HBX-regulated miRNAs in HCC cells and its potential role in HBV replication.MethodsWe collected fresh specimens with paraffin embedding of HCC tissue and para-carcinoma tissue >2 cm from HCC tissue from 13 HCC patients who were admitted into Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital Affiliated to the Second Military Medical University from January to October in 2014.Microarry technology was used to analyze the differential expression of HBX-regulated miRNAs.Quantitative analysis was conducted to investigate the expression of seven miRNAs relevant with liver function and HBX mRNA in HCC tissue and para-carcinoma tissue by RT-qPCR method,and the influence of over-expression of hsa-miR-373 and inhibiting-expression of hsa-miR-22 on HBV replication was explored.ResultsThe microarray results showed that there were a total of 46 differential expressions of miRNAs in HepG2-X and HepG2-CAT cell lines,and compared with HepG2-CAT cell line,20 miRNAs expressions were higher and 26 miRNAs expressions were lower in HepG2-X cell line.HCC tissue and para-carcinoma tissue were significantly different in the expression levels of hsa-miR-22,hsa-miR-373,hsa-miR-92 and hsa-miR-155 and the expression level of HBX mRNA(P<0.05);HCC tissues and para-carcinoma tissues were not significantly different in the expression levels of hsa-miR-181a,hsa-miR-34a and hsa-let-7i(P>0.05).Pearson correlation analysis showed that the expression level of hsa-miR-22 was postitvely correlated with the expression level of HBX mRNA(r=0.415，P=0.018),and there was negative correlation between the expression level of hsa-miR-373,hsa-miR-92 and hsa-miR-155 and the expression level of HBX mRNA(r=-0.322，P=0.043；r=-0.369，P=0.028；r=-0.426，P=0.016);no linear correlation existed between the expression level of hsa-miR-181a,hsa-miR-34a and hsa-let-7i and the expression level of HBX mRNA(r=0.076，P=0.363；r=0.017，P=0.676；r=0.122，P=0.242).On day 2 and day 3,hsa-miR-22 inhibition group and hsa-miR-373 precursor group were higher than negative control group in HBV replication number of HepG2.2.15 and HepAD-38 cell lines(P<0.05);on day 2 and day 3,hsa-miR-373 precursor group was lower than hsa-miR-22 inhibition group in HBV replication number of HepG2.2.15 cell line(P<0.05).On day 2,hsa-miR-373 precursor group was higher than hsa-miR-22 inhibition group in HBV replication number of HepAD-38 cell line,and on day 3,hsa-miR-373 precursor group was lower than hsa-miR-22 inhibition group in HBV replication number of HepAD-38 cell line(P<0.05).On day 2 and day 3,hsa-miR-373 precursor group was higher than hsa-miR-22 inhibition group in the inhibition rate of HBV replication of HepG2.2.15 cell line(P<0.05).On day 2,hsa-miR-373 precursor group was lower than hsa-miR-22 inhibition group in the inhibition rate of HBV replication of HepAD-38 cell line,and on day 3,hsa-miR-373 precursor group was higher than hsa-miR-22 inhibition group in the inhibition rate of HBV replication of HepAD-38 cell line(P<0.05).ConclusionThe regulation of miRNAs by HBX can influence the replication of HBV in HCC cells by target-related signaling pathway.

【Key words】Liver neoplasms；Hepatitis B virus X protein；Micro-RNAs；Virus replication

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(91029723)

通信作者：陳靜，200437上海市締達(dá)生物科技有限公司；E-mail:dida_bio@163.com

【中圖分類號(hào)】R 512.62

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.010

(收稿日期：2015-12-03；修回日期：2016-03-16)