白方會，李 慧，姜婷婷，魏賑權，洪 新，陳寶田

·論著·

正天丸對偏頭痛模型大鼠三叉神經二級神經元P2X3受體表達的影響研究

白方會，李 慧，姜婷婷，魏賑權，洪 新，陳寶田

510515廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學(白方會，魏賑權，洪新，陳寶田)；廣州市紅十字會醫(yī)院中醫(yī)科(李慧)；南方醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院神經內科(姜婷婷)

【摘要】目的探究正天丸對偏頭痛模型大鼠三叉神經二級神經元P2X3受體表達的影響。方法2014年9—10月選取SPF級SD雄性大鼠30只，采用隨機數字表法分為3組，分別為對照組、模型組、正天丸組，每組10只。正天丸組大鼠給予1.62 g·kg-1·d-1正天丸灌胃，對照組和模型組大鼠給予1 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，各組大鼠連續(xù)給藥 7 d。模型組、正天丸組大鼠末次灌胃30 min后左側肩部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油注射液，制備實驗性偏頭痛動物模型，對照組大鼠同期左側肩部皮下注射0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液。觀察各組大鼠耳紅出現、消失時間及撓頭開始、結束時間等行為學表現，采用免疫熒光、Western blotting法、實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠三叉神經頸髓復合體(TCC)中P2X3受體及其mRNA表達水平。結果模型組和正天丸組大鼠耳紅出現時間、撓頭開始時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；正天丸組大鼠耳紅消失時間和撓頭結束時間均較模型組提前(P<0.05)。免疫熒光結果顯示，對照組、模型組和正天丸組大鼠三叉神經TCC中均有P2X3受體陽性表達，主要分布在三叉神經脊束核尾部(TNC)和C1、C2頸髓背側核淺層(Ⅰ、Ⅱ層)，模型組表達亮度較對照組升高，正天丸組表達亮度較模型組降低。模型組和正天丸組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體及其mRNA表達水平較對照組升高(P<0.05)；正天丸組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體及其mRNA表達水平較模型組降低(P<0.05)。結論正天丸對偏頭痛的治療作用可能與其可以抑制三叉神經二級神經元P2X3受體表達上調有關。

【關鍵詞】偏頭痛；三叉神經；神經元；正天丸；P2X3受體

白方會，李慧，姜婷婷，等.正天丸對偏頭痛模型大鼠三叉神經二級神經元P2X3受體表達的影響研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(15)：1828-1832.[www.chinagp.net]

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偏頭痛為一種突發(fā)性神經與血管功能障礙，以反復發(fā)作的單側或雙側頭部嚴重的搏動性疼痛為特點[1]。我國偏頭痛年患病率女性為3.3%～32.6%，男性為0.7%～16.1%[2]。該病發(fā)病率高、治愈率低，目前缺乏安全有效的治療措施，嚴重影響患者的生活質量，2010年全球疾病負擔調查將偏頭痛列為全球第七位高致殘性疾病[3]。偏頭痛的發(fā)病機制至今尚未完全闡明，三叉神經血管反射學說是目前研究偏頭痛發(fā)病機制的主流學說，三叉神經血管系統的激活是偏頭痛發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，三叉神經脊束核尾部(trigeminal nucleus caudalis,TNC)和C1、C2頸髓背側核統稱為三叉神經頸髓復合體(TCC)[4]，是三叉神經二級神經元，當偏頭痛發(fā)作時TCC興奮性增高。P2X3受體屬于配體門控型非選擇性陽離子通道嘌呤能受體，其選擇性高表達于處理傷害信息的感覺神經元上，豐富表達于三叉神經感覺核[5-6]。偏頭痛發(fā)作時，三叉神經二級神經元P2X3受體表達水平明顯上調[7-8]。以往實驗研究表明，正天丸可以通過降低血管阻力、增加腦血流量、改善微循環(huán)、調節(jié)多種血管活性物質等，發(fā)揮抗偏頭痛作用[9]。正天丸對P2X3受體表達的影響，目前尚不清楚。本實驗通過觀察正天丸對硝酸甘油誘發(fā)偏頭痛模型大鼠三叉神經二級神經元P2X3受體表達的影響，探討其對偏頭痛的防治機制，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物2014年9—10月選取SPF級SD雄性大鼠30只，周齡9～11周，平均周齡(9.8±1.6)周；體質量250～300 g，平均體質量(280±20)g。大鼠由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，飼養(yǎng)條件：室內溫度 22～26 ℃，相對濕度40%～60%，光暗周期12 h，自由攝取充足的水和食物，動物模型制備前適應性喂養(yǎng)7 d。動物實驗遵循國家科技部 2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的要求[10]。

1.2實驗藥物與試劑硝酸甘油注射液購于北京益民藥業(yè)有限公司(藥品批號：131122)，正天丸購于華潤三九醫(yī)藥股份有限公司(藥品批號：1308002H)，0.9%氯化鈉溶液購于貴州天地藥業(yè)有限責任公司(藥品批號：A14050812)，10%水合氯醛(用量0.4 ml/100 g)為實驗室自配，4%多聚甲醛溶液購于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，P2X3兔多克隆抗體購于Santa Cruz Biotechnology，免疫熒光二抗-抗兔Cy3購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，β-actin抗體購于北京中杉金橋生物技術有限公司，BCA試劑盒和ECL發(fā)光液購于碧云天生物技術研究所，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購于Millipore公司，SyBrⅠ實時熒光定量PCR檢測試劑盒、MX3005P實時熒光定量PCR儀購于Stratagene公司，IS 2000 MM圖像工作站購于Kodak公司。

1.3分組及偏頭痛模型的建立采用隨機數字表法將大鼠分為3組，分別為對照組、模型組、正天丸組，每組10只。3組大鼠周齡、體質量比較，差異無統計學意義(P>0.05，見表1)。正天丸組大鼠給予1.62 g·kg-1·d-1正天丸灌胃(藥物劑量根據成人常規(guī)每日口服劑量進行換算)；對照組和模型組大鼠給予1 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃。各組大鼠連續(xù)給藥 7 d。模型組、正天丸組大鼠末次灌胃30 min后左側肩部皮下注射10 mg/kg硝酸甘油注射液，制備實驗性偏頭痛動物模型[11]；對照組大鼠同期左側肩部皮下注射0.5 ml 0.9%氯化鈉溶液。

表1　3組大鼠周齡、體質量比較±s)

1.4行為學觀察以大鼠出現耳紅、前肢頻繁撓頭、煩躁不安等行為視為造模成功[12]。觀察指標：(1)模型組和正天丸組大鼠皮下注射硝酸甘油注射液后耳紅出現時間和耳紅消失時間；(2)模型組和正天丸組大鼠皮下注射硝酸甘油注射液后撓頭開始時間和撓頭結束時間，其中撓頭開始時間以大鼠出現連續(xù)撓頭達5次及以上為標志，撓頭結束時間以30 min內大鼠撓頭次數不足5次且出現倦怠、疲乏狀態(tài)為標志。

1.5標本采集與指標檢測

1.5.1免疫熒光造模4 h后，各組采用隨機數字表法取4只大鼠，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，經心尖部插管至升主動脈，剪開右心耳，4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液快速灌注至流出液清亮，繼而用4%多聚甲醛溶液灌注固定，先快后慢，灌注至大鼠尾巴變僵硬。斷頭取延髓至上頸段脊髓(至C2)，放入4%多聚甲醛溶液固定24 h，次日依次放入10%、20%、30%蔗糖脫水至沉底。石蠟包埋切片，片厚10 μm。切片進行脫蠟和水化、熱抗原修復、滅火內源性過氧化物酶后，滴加5%牛血清清蛋白(BSA)封閉液封閉15 min以封閉非特異性抗原，隨后加入一抗—P2X3兔多克隆抗體(sc-25694，1∶500)，4 ℃環(huán)境下過夜。滴加免疫熒光二抗-抗兔Cy3(Cat:KGIF010，1∶500)，避光孵育1 h，每個環(huán)節(jié)間均用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，5 min/次，加抗淬滅劑，中性樹膠封固，倒置熒光顯微鏡下觀察結果，紅色為標記的P2X3受體，對照組以PBS作為一抗。

1.5.2Western blotting法造模4 h后，各組采用隨機數字表法取3只大鼠，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速冰上取延髓至上頸段脊髓(至C2)，-80 ℃液氮保存。將同組內所有樣品進行等量混合以消除組內差異，取混合物50 mg進行液氮研磨，加入150 μl RIPA裂解液及1.5 μl 苯甲基磺酰氟(PMSF)冰上孵育30 min，4 ℃ 1 500 r/mim離心15 min(離心半徑13.5 cm)，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。每個樣本各取50 μg進行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST沖洗3次，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，HRP偶聯的山羊抗兔二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光法在IS 2000 MM圖像工作站進行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0(Kodak) 軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內參，每組重復檢測3次。

1.5.3實時熒光定量PCR法造模4 h后，各組剩余3只大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速冰上取延髓至上頸段脊髓(至C2)，-80 ℃液氮保存。按照SyBrⅠ實時熒光定量PCR檢測試劑盒說明書進行各樣本總RNA的提取和cDNA的轉錄，反轉錄條件為25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列如下：P2X3上游引物為5′-TCTTGAGGGTAGGGGATGTG-3′，下游引物為5′-CACACCCAGCCGATCTTAAT-3′； GAPDH上游引物為5′-ATTCTCAGCAATGCATC-3′，下游引物為5′-ATGGACTGTGGTCATGAGCC-3′。實時熒光定量PCR反應體系20 μl：蒸餾水(dH2O)7 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，Taq酶10 μl。PCR反應條件：95 ℃ 10 s，58 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，共45個循環(huán)。采用MX3005P實時熒光定量PCR儀讀取P2X3和GAPDH的循環(huán)閾值，采用相對定量法(2-ΔΔCT)計算各樣本P2X3mRNA的ΔCT值：ΔCT值=目的基因CT值-內參基因CT值。每組重復檢測3次。

2結果

2.1各組大鼠行為學表現對照組大鼠未出現耳朵發(fā)紅，偶有撓頭現象，模型組和正天丸組大鼠在造模4min左右均出現耳紅、前肢頻繁撓頭及煩躁不安等行為。模型組和正天丸組大鼠耳紅出現時間、撓頭開始時間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；正天丸組大鼠耳紅消失時間和撓頭結束時間均較模型組提前，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

Table 2Comparison of the appearing and disappearing time of red ear and the beginning and ending time of scratching head between model group and Zhengtian pills group

組別只數耳紅出現時間耳紅消失時間撓頭開始時間撓頭結束時間模型組104.0±0.8135.5±8.14.3±1.2137.3±6.1正天丸組103.8±0.9101.4±8.54.0±0.8101.5±6.1t值0.5149.1910.66913.076P值0.613<0.0010.512<0.001

2.2免疫熒光結果免疫熒光結果顯示，對照組、模型組和正天丸組大鼠三叉神經TCC中均有P2X3受體陽性表達(紅色熒光顆粒)，主要分布在TNC和C1、C2頸髓背側核淺層(Ⅰ、Ⅱ層)，模型組表達亮度較對照組升高，正天丸組表達亮度較模型組降低(見圖1，本文圖1彩圖見本刊官網www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

注：A為對照組，B為模型組，C為正天丸組

圖13組大鼠三叉神經TCC中P2X3的表達(免疫熒光，×100)

Figure 1Expression of P2X3in TCC among the three groups

2.3Western blotting法結果3組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中模型組和正天丸組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體表達水平較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；正天丸組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體表達水平較模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表3、圖2)。

Table3ComparisonoftheexpressionlevelofP2X3receptorinTCCofthethreegroups

組別P2X3受體對照組0.34±0.02模型組1.02±0.02a正天丸組0.84±0.06abF值225.795P值<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖2Western blotting法檢測3組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體的表達水平電泳圖

Figure 2Electrophoregrams of expression level of P2X3receptor in TCC of the three groups detected by Western blotting method

2.4實時熒光定量PCR法結果3組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；其中模型組和正天丸組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體mRNA表達水平較對照組升高，差異有統計學意義(P<0.05)；正天丸組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體mRNA表達水平較模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05，見表4)。

表43組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體mRNA表達水平比較

Table 4Comparison of the mRNA expression of P2X3receptor in TCC among the three groups

組別P2X3受體mRNA對照組1.00±0.05模型組2.53±0.23a正天丸組1.39±0.42abF值48.296P值<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

3討論

TCC作為偏頭痛發(fā)病機制中三叉神經血管通路的二級神經元，可以將三叉神經末梢感受器傳遞而來的傷害性感受信息進一步傳遞到丘腦，直至大腦皮質，從而產生頭痛，同時發(fā)出沖動刺激位于延髓的嘔吐中樞引起惡心、嘔吐表現[13]。

大鼠皮下注射硝酸甘油注射液后，其代謝產物一氧化氮(NO)能夠誘導TNC中傷害性疼痛標志物Fos的表達，激活三叉神經血管系統，誘發(fā)偏頭痛[14]。硝酸甘油誘發(fā)偏頭痛大鼠模型具有造模方法簡捷、模型間相似性好、對動物創(chuàng)傷小、易于復制、能在清醒狀態(tài)下觀察大鼠行為學表現等優(yōu)點，是目前國內應用較成熟且普遍的偏頭痛動物模型[15]。行為學表現是評價偏頭痛造模成功的一項重要指標[9]，本實驗大鼠皮下注射硝酸甘油注射液4 min左右即出現耳紅、前肢頻繁撓頭及煩躁不安等行為，說明造模成功。

P2X3受體選擇性高表達于處理傷害性信息的感覺神經元上[6]，具有較高的Ca2+通透性，可以介導多種急、慢性疼痛，已經成為疼痛治療領域的新靶點[7]。激活三叉神經感覺核的P2X3受體可引起Ca2+內流，增加谷氨酸釋放，以增強興奮性突觸傳遞并介導炎性反應的中樞敏化[16]。P2X3受體相關信號分子通過長時程逆行傳遞增加細胞體內環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)和其他分子的活化水平，從而保持神經元的活性和興奮性，CREB活化有助于維持與慢性炎癥相關的長期疼痛的敏感性[17]。本實驗應用免疫熒光和Western blotting法檢測各組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體表達水平，實時熒光定量PCR法檢測各組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體mRNA表達水平，結果顯示，對照組和模型組大鼠三叉神經TCC中均有P2X3受體陽性表達，模型組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體及其mRNA表達水平較對照組升高。文獻報道，P2X3受體初級傳入纖維呈彌散型終止于吻側三叉神經感覺核(包括三叉神經感覺主核、三叉神經脊束核脊間亞核和吻側亞核)，呈密集型終止于三叉神經脊束核尾側亞核淺層，主要位于其膠狀質[5]；P2X3受體在野生型小鼠感覺神經元亦有較低水平的表達，但在家族性偏癱型偏頭痛Ⅰ型轉基因模型小鼠三叉神經感覺神經元呈組成型上調狀態(tài)[18]，三叉神經感覺神經元P2X3受體表達水平上調與偏頭痛發(fā)作有相關性[19-21]。本研究結果證實，皮下注射硝酸甘油注射液可以成功模擬偏頭痛的發(fā)作，激活了三叉神經血管系統，并通過上調三叉神經TCC中P2X3受體的表達水平，介導偏頭痛的發(fā)生、發(fā)展。

正天丸是由中醫(yī)治療頭痛4大古方(川芎茶調散、麻黃附子細辛湯、桃紅四物湯、四藤消震飲)中的15味中草藥組成的中藥復方制劑，具有疏風活血、養(yǎng)血平肝、通絡止痛等功效，是目前臨床治療偏頭痛的主要中成藥之一[22]。臨床隨機、雙盲、多中心、對照研究顯示，正天丸能減輕偏頭痛患者的發(fā)作強度、程度，減少發(fā)作頻率，縮短頭痛持續(xù)時間，臨床療效確切，患者耐受性好，且無明顯不良反應[23]。正天丸對偏頭痛模型大鼠癥狀的改善類似于氟桂利嗪[9]。本研究結果顯示，正天丸組大鼠耳紅消失時間和撓頭結束時間均較模型組提前，表明正天丸可以降低偏頭痛的持續(xù)時間。文獻報道，正天丸可以升高實驗動物血漿及腦干中5-羥色胺(5-HT)水平，降低血漿中降鈣素基因相關肽(CGRP)、內皮素(ET)、NO水平[9,24]。本實驗結果顯示，正天丸組大鼠三叉神經TCC中P2X3受體及其mRNA表達水平均較模型組降低，說明正天丸可以抑制偏頭痛發(fā)作時三叉神經TCC中P2X3受體的表達，從而發(fā)揮抗偏頭痛的作用。

綜上所述，三叉神經二級神經元P2X3受體表達上調介導了偏頭痛的發(fā)作，正天丸可以通過降低偏頭痛模型大鼠三叉神經二級神經元P2X3受體的過表達從而起到治療偏頭痛的作用，為其臨床療效提供了有力的理論依據。但偏頭痛的發(fā)病機制較復雜，目前對于正天丸對偏頭痛發(fā)作時腦內神經遞質影響方面的研究較少，有待進一步深入研究其對P2X3受體的作用機制及對其他神經遞質的干預作用，從而更全面更深入地了解正天丸的抗偏頭痛機制。

作者貢獻：白方會進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；李慧、姜婷婷、魏賑權、洪新進行實驗實施、評估、資料收集；陳寶田進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effect of Zhengtian Pills on P2X3Receptor Expression in Secondary Neurons of Trigeminal Nerve of Rat Model of Migraine

BAIFang-hui,LIHui,JIANGTing-ting,etal.

SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of Zhengtian pills on P2X3 receptor expression in secondary neurons of trigeminal nerve of rat model of migraine.MethodsFrom September to October in 2014,we selected 30 SPF grade Sprague-Dawle(SD) male rats and using the random number table method divided them into three groups:control group,model group and Zhengtian pills group,with 10 rats in each group.Rats of Zhengtian pills group was given 1.62 g·kg-1·d-1Zhengtian pills by gavage,rats of control group and model group were given 1 m 0.9% sodium chloride solution by gavage.The drug administration lasted for 7 days.In model group and Zhengtian pills group,migraine rat models were established by subcutaneous injection of nitroglycerin(10 mg/kg) at the left shoulder at 30 min after the last drug administration.Rats of control group were given 0.5 ml 0.9% sodium chloride solution by subcutaneous injection at the left shoulder.Behavioural performances of the rats were observed,including the appearing and disappearing time of red ear and the beginning and ending time of scratching head.Immunoflourescence,Western blotting and Real-time PCR were used to detect the expressions of P2X3 receptor and its mRNA in trigeminocervical complex(TCC).ResultsModel group and Zhengtian pills group were not significantly different in the appearing time of red ear and the beginning time of scratching head(P>0.05).Zhengtian pills group had earlier disappearing time of red ear and earlier ending time of scratching head than model group(P<0.05).Immunofluorescence results showed that the expression of P2X3 receptors in TCC was positive in the rats of each group,mainly distributed in the TNC andⅠ,Ⅱ layer of C1,C2 cervical spinal dorsal nucleus,and the expression of model group was higher than control group and Zhengtian pills group.The expression levels of P2X3 receptor and its mRNA in TCC of model group and Zhengtian pills group were higher than those of control group(P<0.05),while the expression levels of P2X3 receptor and its mRNA of Zhengtian pills group were lower than those of model group(P<0.05).ConclusionThe effect of Zhengtian pills on the treatment of migraine may be related with its inhibition on the expression of P2X3 receptors in secondary neurons of trigeminal nerve.

【Key words】Migraine disorders；Trigeminal nerve；Neurons；Zhengtian pills；P2X3 receptors

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81202687)；廣東省科技計劃項目(2012B061700018)；廣東省中醫(yī)藥管理局科研課題(20141218)

通信作者：陳寶田，510515廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學；E-mail:gy33mail@126.com

【中圖分類號】R 747.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.018

(收稿日期：2015-12-03；修回日期：2016-02-16)

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