徐海艷　吳瑋,　王剛　陳娜　張弛　屈昌北　王鴻南　李保衛(wèi)　韓浩倫　周麗斌

?

·實(shí)驗(yàn)研究·

低頻強(qiáng)聲暴露后巴馬香豬耳蝸caspase-3表達(dá)及毛細(xì)胞死亡觀察

徐海艷1吳瑋1,2王剛2陳娜2張弛2屈昌北2王鴻南2李保衛(wèi)2韓浩倫2周麗斌2

【摘要】目的了解高強(qiáng)度低頻噪聲(下稱：低頻強(qiáng)聲)暴露對(duì)巴馬香豬耳蝸凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表達(dá)的影響，同時(shí)觀察耳蝸毛細(xì)胞死亡情況。方法將8只巴馬香豬隨機(jī)分為對(duì)照組2只及實(shí)驗(yàn)組6只；所有動(dòng)物均于實(shí)驗(yàn)前行聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)，然后將實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為噪聲暴露后即刻組、36 h組及84 h組，每組各2只，分別暴露于50 Hz、142 dB SPL的噪聲中5 min，于噪聲暴露后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行ABR檢測(cè)，用免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光DAPI標(biāo)記細(xì)胞核兩種方法觀察耳蝸組織中caspase-3的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法計(jì)算毛細(xì)胞缺失率判定細(xì)胞死亡情況。對(duì)照組不給予噪聲暴露，其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同。結(jié)果噪聲暴露前8只巴馬香豬的ABR平均閾值為61.25±10.72 dB nHL；低頻強(qiáng)聲暴露后實(shí)驗(yàn)組中的即刻組、36 h組和84 h組的動(dòng)物雙耳ABR均未引出；實(shí)驗(yàn)各組動(dòng)物耳蝸各部位均可見(jiàn)caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，且隨著暴露后時(shí)間延長(zhǎng)，caspase-3陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱；噪聲暴露后即刻組、36 h組與正常對(duì)照組相比較，耳蝸三排外毛細(xì)胞排列及層次明顯錯(cuò)亂；噪聲暴露后84 h組耳蝸三排外毛細(xì)胞消失，僅可見(jiàn)一層內(nèi)毛細(xì)胞；正常對(duì)照組及噪聲暴露后即刻組、36 h組、48 h組耳蝸外毛細(xì)胞缺失率分別為0%、0%、14.06%、100%。結(jié)論低頻強(qiáng)聲暴露使巴馬香豬聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾值較暴露前明顯提高，隨暴露后時(shí)間延長(zhǎng)，耳蝸組織中caspase-3陽(yáng)性表達(dá)減弱，毛細(xì)胞死亡數(shù)量明顯增加，螺旋神經(jīng)節(jié)區(qū)域也出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

【關(guān)鍵詞】低頻強(qiáng)聲；小型豬；毛細(xì)胞死亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

噪聲普遍存在于我們生存的環(huán)境中，給人類(lèi)生產(chǎn)、生活帶來(lái)諸多的困擾，甚至可導(dǎo)致不同程度的聽(tīng)力損傷。研究[1]證實(shí)高強(qiáng)度低頻噪聲(下稱：低頻強(qiáng)聲)暴露后大鼠耳蝸Corti器、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、血管紋和螺旋韌帶均可見(jiàn)凋亡因子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的陽(yáng)性表達(dá)。目前，對(duì)低頻強(qiáng)聲致大型哺乳動(dòng)物耳蝸損傷的研究較少，本研究擬通過(guò)觀察低頻強(qiáng)聲對(duì)巴馬香豬聽(tīng)功能的影響、耳蝸凋亡因子caspase-3的表達(dá)變化及耳蝸毛細(xì)胞死亡情況，探討其導(dǎo)致大型哺乳動(dòng)物耳蝸損傷的可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為外耳道潔凈且健康的巴馬香豬8只(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重10～20 kg，雌雄各半，分為對(duì)照組2只，實(shí)驗(yàn)組6只(噪聲暴露后即刻、36 h、84 h組各2只)。

1.2低頻強(qiáng)聲暴露方法低頻強(qiáng)聲發(fā)生設(shè)備由動(dòng)力源、低頻信號(hào)發(fā)射器、功率放大器和聲源發(fā)生器組成(第三軍醫(yī)大學(xué)提供)。聲源頻率為50 Hz，強(qiáng)度為142 dB SPL，將實(shí)驗(yàn)組巴馬香豬置于低頻強(qiáng)聲聲場(chǎng)環(huán)境內(nèi)，每只持續(xù)暴露5 min。對(duì)照組除不給予低頻強(qiáng)聲暴露外其他條件與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.3聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均于實(shí)驗(yàn)前檢測(cè)ABR，實(shí)驗(yàn)組再于低頻強(qiáng)聲暴露后即刻、36 h及48 h分別測(cè)試ABR。ABR測(cè)試方法：動(dòng)物經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥(1 mg/kg)麻醉后，在隔聲靜電屏蔽室內(nèi)進(jìn)行雙耳ABR反應(yīng)閾測(cè)試；顱頂正中接記錄電極，測(cè)試耳為參考電極，鼻尖處為地極，單耳閉合聲場(chǎng)給聲。刺激聲為短音，帶通濾波為100～3 000 Hz，信號(hào)放大100 000倍，刺激重復(fù)率21.1次/秒，聲刺激持續(xù)時(shí)間100 μs，間隔10 ms，疊加1 024次；刺激聲強(qiáng)度從95 dB nHL開(kāi)始，先以10 dB遞減，接近反應(yīng)閾時(shí)以5 dB遞減，以剛引出可重復(fù)出現(xiàn)比較穩(wěn)定的波V的刺激強(qiáng)度判斷為ABR反應(yīng)閾；如果95 dB nHL不能引出反應(yīng)閾則默認(rèn)其閾值為100 dB nHL。測(cè)試時(shí)注意動(dòng)物保溫。

1.4耳蝸標(biāo)本制備將對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各組動(dòng)物按相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)行ABR測(cè)試后迅速斷頭取出聽(tīng)泡，挑出鐙骨，暴露卵圓窗，4%多聚甲醛溶液固定，EDTA溶液脫鈣40天(每天換液)；脫鈣完成后統(tǒng)一時(shí)間行免疫組化染色及免疫熒光染色。

1.5免疫組化及免疫熒光染色試劑：抗caspase-3兔多克隆抗體(即ab4051,Abcam公司)，羊抗兔IgG(Abcam公司)。免疫組織化學(xué)染色法：將耳蝸石蠟包埋后切片、脫水；PBS溶液沖洗；2%雙氧水去除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶10 min，PBS溶液沖洗；BSA封閉；加抗caspase-3抗體(用PBS以1:100配比)，4 ℃過(guò)夜，PBS溶液沖洗；加入二抗(二抗試劑盒)1 h，PBS溶液沖洗；DAB顯色，檢測(cè)Corti器、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)caspase-3的表達(dá)；以PBS溶液代替抗caspase-3抗體作為陰性對(duì)照，選擇扁桃體組織切片(根據(jù)Abcam公司提供的ab4051說(shuō)明書(shū)要求選擇成人無(wú)炎性反應(yīng)的肥大扁抗體組織為陽(yáng)性對(duì)照)作為陽(yáng)性對(duì)照。以內(nèi)耳各部位(Corti器、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié))出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照相應(yīng)的棕褐色顆粒判斷為caspase-3陽(yáng)性表達(dá)。

采用免疫熒光法檢測(cè)耳蝸基底膜caspase-3的表達(dá)。步驟如下：在體視顯微鏡(日本，OLYMPUS,SZX10)下去除耳蝸骨蝸殼、膜蝸殼、螺旋韌帶、前庭膜及蓋膜。將基底膜與蝸軸分離，將基底膜放置于4%多聚甲醛溶液過(guò)夜，換成PBS溶液，置于0.01 mmol/L PBS沖洗3次，每次間隔10 min；10%山羊血清封閉，常溫下30 min；抗caspase-3抗體以1:100和PBS配比，4 ℃過(guò)夜； PBS 10 min，共3次；羊抗兔二抗(濃度為1:200)避光孵育，室溫1 h， PBS 10 min，共2次，30 min 1次，避光；加入DAPI溶液，室溫10 min， PBS 5 min，3次，避光；甘油封片。Leica880熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司，LSM880)給予藍(lán)色及綠色激發(fā)光觀察標(biāo)本。陰性對(duì)照選用未經(jīng)噪聲暴露的巴馬香豬(對(duì)照組)耳蝸基底膜，用PBS代替一抗進(jìn)行孵育，其余步驟與上述處理相同。DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，細(xì)胞核缺失計(jì)為死亡的細(xì)胞，取耳蝸底回基底膜，于63倍共聚焦顯微鏡下取圖并進(jìn)行毛細(xì)胞死亡計(jì)數(shù)。

2結(jié)果

2.1對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組噪聲暴露前后ABR反應(yīng)閾比較兩組巴馬香豬噪聲暴露前ABR反應(yīng)閾為50～80 dB nHL，平均61.25±10.72 dB nHL；噪聲暴露后各實(shí)驗(yàn)組ABR均未引出。

圖1　正常對(duì)照組及噪聲暴露后各組耳蝸Corti器、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)caspase-3表達(dá)

正常對(duì)照組(a1、b1、c1)耳蝸Corti器、螺旋韌帶及螺旋神經(jīng)節(jié)未見(jiàn)caspase-3的表達(dá)；噪聲暴露后即刻組(a2、b2、c2)、36 h組(a3、b3、c3)、84 h組(a4、b4、c4)耳蝸Corti器、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，且各部位caspase-3表達(dá)水平依次逐漸減低

圖2　正常對(duì)照組及噪聲暴露后即刻組、36 h組、84 h組各組耳蝸免疫熒光染色底回外毛細(xì)胞中caspase-3表達(dá)

正常對(duì)照組(a)未見(jiàn)caspace-3表達(dá)；噪聲暴露后即刻組(b)及36 h組(c)三排外毛細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，即刻組(b)較36 h組(c)表達(dá)水平高；噪聲暴露后84 h組(d)外毛細(xì)胞消失，內(nèi)毛細(xì)胞仍存在且caspase-3表達(dá)陽(yáng)性

圖3　正常對(duì)照組及噪聲暴露后各組耳蝸底回基底膜DAPI核染色圖　正常組(a)，即刻組(b)，36 h組(c),84 h組(d)

2.2各組免疫組化染色耳蝸caspase-3表達(dá)情況正常對(duì)照組(圖a1、b1、c1)耳蝸Corti器、螺旋韌帶及螺旋神經(jīng)節(jié)未見(jiàn)caspase-3的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組中噪聲暴露后即刻組(圖a2、b2、c2)、36 h組(圖a3、b3、c3)、84 h組(圖a4、b4、c4)耳蝸Corti器、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中均可見(jiàn)caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，且caspase-3表達(dá)水平依次逐漸減低；實(shí)驗(yàn)組同一時(shí)間點(diǎn)血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)caspase-3陽(yáng)性表達(dá)水平與Corti器、螺旋韌帶相一致。

2.3各組免疫熒光染色觀察caspase-3表達(dá)及毛細(xì)胞缺失率實(shí)驗(yàn)組中噪聲暴露后即刻組(圖2b)及36 h組(圖2c)三排外毛細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，即刻組caspase-3陽(yáng)性表達(dá)水平較36 h組高；噪聲暴露后84 h組(圖2d)外毛細(xì)胞消失，內(nèi)毛細(xì)胞仍存在且caspase-3表達(dá)陽(yáng)性。

正常組(圖3a)毛細(xì)胞缺失率為0%(0/68)，即刻組(圖3b)毛細(xì)胞缺失率為0%(0/70)，36 h組(圖3c)毛細(xì)胞缺失率為14.06%(9/64),84 h組(圖3d)毛細(xì)胞缺失率為100%。正常對(duì)照組三排外毛細(xì)胞細(xì)胞核排列整齊，36 h組較正常對(duì)照組細(xì)胞核排列不規(guī)則且層次錯(cuò)亂；噪聲暴露后84 h組三排外毛細(xì)胞消失，一排內(nèi)毛細(xì)胞仍存在。

3討論

噪聲對(duì)聽(tīng)功能的危害是其最顯著的影響[2,3]。與高頻噪聲相比，低頻噪聲具有衰減慢、聲波長(zhǎng)及較易穿透障礙物的特點(diǎn)[4]，目前研究顯示高強(qiáng)度低頻率噪聲暴露可使大鼠[5]、豚鼠[6]聽(tīng)性腦干反應(yīng)閾明顯提高，同時(shí)激活了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶凋亡因子caspase-3[1]；王建軍等[6]發(fā)現(xiàn)經(jīng)100 Hz、130 dB SPL噪聲暴露后豚鼠的聽(tīng)力發(fā)生大約20 dB的暫時(shí)性閾移，1天后其聽(tīng)力有所恢復(fù)；既往研究[5]發(fā)現(xiàn)暴露于150 dB、100 Hz噪聲環(huán)境10 min后大鼠聽(tīng)力下降，閾移大于60 dB，噪聲暴露后隨著時(shí)間的推移閾移逐漸減小。文中結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組巴馬香豬暴露于50 Hz、142 dB SPL低頻強(qiáng)聲5 min后ABR均不能引出，閾移大于30 dB?？梢?jiàn)低頻強(qiáng)聲所產(chǎn)生的聽(tīng)損傷隨著噪聲強(qiáng)度增加聽(tīng)損傷加重。

噪聲導(dǎo)致聽(tīng)力損傷的機(jī)制一直受到學(xué)界的普遍關(guān)注?，F(xiàn)有研究普遍認(rèn)為[1]噪聲暴露可以導(dǎo)致耳蝸外毛細(xì)胞的壞死和凋亡，且以凋亡為主。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)上游caspase家族蛋白激活，介導(dǎo)相應(yīng)底物(即有關(guān)DNA)的切割[7]；caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性蛋白酶[8]。從本研究結(jié)果看低頻強(qiáng)聲暴露后實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物耳蝸基底膜上三排外毛細(xì)胞中均可見(jiàn)caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)；同時(shí)免疫熒光及免疫組化兩種方法均可見(jiàn)噪聲暴露后即刻組caspase-3表達(dá)水平最高，隨著低頻強(qiáng)聲暴露后時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)水平逐漸下降，與既往關(guān)于低頻強(qiáng)聲對(duì)大鼠聽(tīng)功能影響的研究結(jié)果[1]一致，可見(jiàn)隨著暴露后時(shí)間延長(zhǎng)低頻強(qiáng)聲所致的凋亡程序誘導(dǎo)水平逐漸降低。

螺旋神經(jīng)節(jié)是聽(tīng)覺(jué)中樞的傳入神經(jīng)元，它的損傷程度直接反映了聽(tīng)功能的受損程度，噪聲對(duì)螺旋神經(jīng)節(jié)的損傷有的繼發(fā)于毛細(xì)胞死亡[9]，有的則在毛細(xì)胞沒(méi)有損傷的情況下出現(xiàn)了螺旋神經(jīng)節(jié)的變形、消亡[10]。本實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)低頻強(qiáng)聲暴露后實(shí)驗(yàn)組耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中caspase-3陽(yáng)性表達(dá)，且與同組Corti器、螺旋韌帶表達(dá)相一致，表明低頻強(qiáng)聲在對(duì)毛細(xì)胞造成影響的同時(shí)可誘導(dǎo)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，這一結(jié)果和薛秋紅[11]觀察的強(qiáng)噪聲對(duì)豚鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡影響的研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DAPI染核的方法觀察到與正常對(duì)照組相比較，低頻強(qiáng)聲暴露后即刻組、36 h組三排外毛細(xì)胞排列及層次明顯錯(cuò)亂；而噪聲暴露后84 h組三排外毛細(xì)胞消失，僅可見(jiàn)一排內(nèi)毛細(xì)胞；可見(jiàn)隨著低頻強(qiáng)聲暴露后時(shí)間的延長(zhǎng)毛細(xì)胞的死亡逐漸加重；此外，兩種染色方法均可見(jiàn)隨低頻強(qiáng)聲暴露后時(shí)間的延長(zhǎng)耳蝸各區(qū)域caspase-3陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，考慮和caspase-3凋亡因子表達(dá)后所致的毛細(xì)胞死亡數(shù)量積累有關(guān)。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的方式之一，caspase-3高表達(dá)說(shuō)明細(xì)胞中凋亡進(jìn)程活躍，細(xì)胞凋亡最終達(dá)到細(xì)胞死亡；推測(cè)隨著噪聲暴露后時(shí)間的推移毛細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但本實(shí)驗(yàn)尚不能得出低頻強(qiáng)聲所致毛細(xì)胞死亡是細(xì)胞凋亡或壞死的明確論斷，噪聲暴露后耳蝸毛細(xì)胞死亡的相關(guān)機(jī)制還有待今后進(jìn)一步深入研究。

4參考文獻(xiàn)

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(2015-07-20收稿)

(本文編輯李翠娥)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-2615：53

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160426.1553.022.html

The Observation of Cochlea Hair Cell Death and Expression of Caspase-3after Intense Low Frequency Noise Exposure in Bama Pig

Xu Haiyan*, Wu Wei, Wang Gang, Chen Na, Zhang Chi, Qu Changbei,Wang Hongnan, Li Baowei, Han Haolun, Zhou Libin

(*Medical College of PLA, Beijing,100853,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of intense low frequency noise on expression of caspase-3 in bama pigs, and observe the death of cochlea hair cell. Methods8 bama pigs were randomly divided into a normal control group(2 pigs) and experimental groups(6 pigs). Auditory brainstem responses(ABR) were tested before the experiment. The control group was the same as the experimental groups except noise exposure. The experimental group was randomly divided into immediate group,36 h group, and 84 h group(2 pigs per group). They were exposed to intense low frequency noise at 142 dB of 50 Hz for 5 min according to the three time points. ABR were tested again before the cochlea were collected at different time points. The expression of caspase-3 was studied through immunohistochemistry and immunofluorescence, hair cell loss rate by counting to determine cell death. ResultsThe average ABR threshold of 8 bama pigs(16 ears) before the exposure was 61.25±10.72 dB nHL. ABR thresholds were not elicited after exposure to the noise. Different parts of bama pigs showed positive expression of caspase-3in two ways. As time prolonged after exposure, the positive expression of caspase-3 gradually weakened. The immediate group and 36 h group, compared with the control group, showed the apparent misplace of three out hair cells in the arrangement and levels. The 84 h group through immunofluorescence lost out hair cells, and only inner hair cells were visible.ConclusionABR thresholds were elevated after noise exposure. The procedure of hair cell nucleus damage and caspase-3 expression is different, and the noise can induce opening apoptotic program of spiral ganglion.

【Key words】Low frequency noise;Swine;Hair cell death;Caspase-3

【中圖分類(lèi)號(hào)】R764.43+3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1006-7299(2016)03-0256-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.03.009

作者簡(jiǎn)介：徐海艷，女，河南人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樵肼曅悦@。通訊作者：吳瑋(Email:entwuwei@126.com)

1解放軍醫(yī)學(xué)院(北京100853)；2解放軍第306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科