葉放蕾　李萌　李世超　王樂　趙堃　朱曉丹　張婷

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·實(shí)驗(yàn)研究·

STAT3和SOCS3蛋白在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及意義

葉放蕾1李萌1李世超1王樂1趙堃1朱曉丹1張婷1

【摘要】目的研究信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)和細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3)在中耳膽脂瘤中的表達(dá)及意義。 方法采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)30例中耳膽脂瘤標(biāo)本與20例正常外耳道皮膚中STAT3及SOCS3蛋白的表達(dá)。 結(jié)果STAT3蛋白陽性表達(dá)定位于胞漿和胞核，其在中耳膽脂瘤上皮中陽性表達(dá)率為76.7%(23/30)，高于正常外耳道皮膚組的25.0%(5/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SOCS3蛋白陽性表達(dá)主要定位于胞漿，其在中耳膽脂瘤上皮的陽性表達(dá)率為33.3%(10/30)，低于正常外耳道皮膚組的65.0%(13/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在30例中耳膽脂瘤上皮組織中， STAT3與SOCS3蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.476,P=0.008，P<0.05)。 結(jié)論STAT3和SOCS3蛋白在中耳膽脂瘤中的異常表達(dá)可能與中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖和凋亡抑制相關(guān)，進(jìn)而參與了膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3；細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子3；膽脂瘤；中耳

中耳膽脂瘤以中耳腔內(nèi)異常增殖、堆積的角化鱗狀上皮和進(jìn)行性骨質(zhì)破壞為特征，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。上皮細(xì)胞異常增殖、凋亡和骨質(zhì)破壞吸收是目前膽脂瘤發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)。Janus蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus protein- tyrosine kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)是一條由細(xì)胞因子激活的信號(hào)通路，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫調(diào)節(jié)等生理過程，其負(fù)反饋調(diào)節(jié)主要由細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(suppressor of cytokine signaling，SOCS)介導(dǎo)[1]。STAT3和SOCS3分別是STATs和SOCSs家族的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞中[2]均存在STAT3和SOCS3的異常表達(dá)，并對(duì)其發(fā)揮促增殖和抗凋亡的效應(yīng)。為了解STAT3和SOCS3蛋白在中耳膽脂瘤中的表達(dá)，本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)中耳膽脂瘤上皮中STAT3和SOCS3蛋白的表達(dá)，并分析兩者之間的相關(guān)性，探討它們?cè)谀懼霭l(fā)生發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1.1標(biāo)本的收集收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科2011年7月～2014年9月收治的中耳膽脂瘤患者手術(shù)清除的膽脂瘤標(biāo)本30例(膽脂瘤組)，其中男12例，女18例；年齡7～74歲，平均42.21±15.85歲，病程9個(gè)月～51年；全部患者術(shù)前臨床診斷及術(shù)后病理診斷均為中耳膽脂瘤。同時(shí)收集其中20例患者術(shù)耳外耳道皮膚作為對(duì)照組(部分患者不同意取外耳道正常皮膚)。所有收集的標(biāo)本均迅速固定后石蠟包埋備用。本研究通過鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，并且所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑鼠抗人STAT3單克隆抗體、鼠抗人SOCS3單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司；即用型SP免疫組化試劑盒。AEC染色劑、MPBS緩沖液粉劑、構(gòu)椽酸緩沖液粉劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物科技公司。

1.3標(biāo)本染色方法兩組標(biāo)本蠟塊連續(xù)切片，行HE染色和免疫組化染色。步驟：石蠟切片脫蠟，充分水化后，PBS沖洗5 min，3次；檸檬酸抗原修復(fù)10 min，自然冷卻；PBS浸泡5 min，3次；3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,室溫下孵育20 min；PBS浸泡5 min，3次；每張片子滴加山羊血清50 μl，室溫條件下封閉內(nèi)源性生物素20分鐘；甩除勿洗，滴加一抗50 μl/片，4 ℃過夜；PBS浸泡5 min，3次；滴加二抗50 μl/片，37 ℃ 30分鐘；PBS浸泡5 min，3次；滴加辣根酶標(biāo)記卵霉鏈白素50 μl/片，37 ℃ 30分鐘；PBS浸泡5 min，3次；DAB顯色，顯微鏡下控制，蒸餾水中止；蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡觀察和照相。用已知陽性片作陽性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，以排除非特異性著色。

1.4結(jié)果判定顯微鏡下觀察STAT3及SOCS3有表達(dá)，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著棕黃色者為陽性表達(dá)細(xì)胞。評(píng)分方法：先按染色程度計(jì)分，無染色0分，微弱棕黃色為1分,棕黃色2分，棕褐色3分；然后在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按染色范圍計(jì)分：無染色0分，<20%為1分，21%～50%為2分；>50%為3分。染色結(jié)果為染色程度和染色范圍之和，0、1分為陰性，2分為弱陽性，3分為陽性，大于等于4分為強(qiáng)陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS21.0充計(jì)分析軟件，STAT3、SOCS3在中耳膽脂瘤組及正常對(duì)照組之間陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)， STAT3、SOCS3在中耳膽脂瘤的相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果中耳膽脂瘤組上皮細(xì)胞層數(shù)增多，鱗狀上皮增生活躍，上皮內(nèi)及上皮下有不同程度的炎性細(xì)胞增生，可見大量角質(zhì)層；正常外耳道皮膚表皮由內(nèi)至外由基底層、棘層、顆粒層、透明層、角質(zhì)層構(gòu)成，未見鱗狀上皮增生活躍及角質(zhì)層增多，上皮內(nèi)及上皮下未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1、2)。

2.2免疫組化染色結(jié)果

2.2.1STAT3在中耳膽脂瘤上皮和正常外耳道皮膚中的表達(dá)STAT3在中耳膽脂瘤上皮全層細(xì)胞的胞漿及胞核強(qiáng)陽性表達(dá)，顏色呈棕黃色，30例中有23例陽性，陽性率76.67%。陰性對(duì)照無染色。在正常外耳道皮膚中可見STAT3在基底細(xì)胞層胞漿少量表達(dá)，棘層及顆粒層未見表達(dá)，整體呈陰性或弱陽性表達(dá)，20例正常外耳道皮膚中，5例陽性表達(dá)，陽性率25.0%；STAT3在中耳膽脂瘤組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3、4，表1)。

表1　STAT3在中耳膽脂瘤上皮和正常

注：*與對(duì)照組比較，χ2=19.431，P=0.000，P<0.05

2.2.2SOCS3在中耳膽脂瘤上皮和正常外耳道皮膚的表達(dá)SOCS3在正常外耳道皮膚全層細(xì)胞的胞漿表達(dá)，顏色呈棕黃色，20例正常外耳道皮膚組織中，13例陽性，陽性率65.0%。陰性對(duì)照無染色，SOCS3在中耳膽脂瘤上皮全層細(xì)胞呈弱陽性或陰性表達(dá)，30例中有10例陽性，陽性率33.33%。SOCS3在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5、6，表2)。

表2　SOCS3在中耳膽脂瘤上皮和正常外耳道皮膚的表達(dá)(例)

注：*與對(duì)照組比較，χ2=9.742，P=0.002，P<0.05

2.2.3STAT3、SOCS3在中耳膽脂瘤組織表達(dá)的相關(guān)性經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，兩因子在中耳膽脂瘤組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，r=-0.476，P=0.008(P<0.05)(表3)；而在正常外耳道皮膚中的表達(dá)不存在負(fù)相關(guān)。

表3　中耳膽脂瘤組織中STAT3和SOCS3

注：STAT3和SOCS3蛋白在中耳膽脂瘤中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，P<0.05

圖1　正常外耳道皮膚染色(HE×400)

3討論

目前，人們對(duì)中耳膽脂瘤發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在上皮細(xì)胞異常增殖、凋亡和骨質(zhì)破壞吸收三方面[3]，但其具體機(jī)制尚未明確。大量關(guān)于膽脂瘤上皮細(xì)胞增殖和凋亡狀態(tài)的研究顯示，復(fù)層鱗狀上皮的過度增殖可能參與了中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展。而關(guān)于其凋亡狀態(tài)的研究仍存在分歧：一些學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤上皮細(xì)胞凋亡增加[4]，進(jìn)而導(dǎo)致中耳腔內(nèi)角化鱗狀上皮異常堆積；而新近的研究認(rèn)為膽脂瘤上皮細(xì)胞的凋亡能力下降[5]，即抗凋亡(anti-apoptosis)；由于凋亡減少，細(xì)胞增殖大于凋亡，從而導(dǎo)致膽脂瘤上皮增生。本研究從細(xì)胞增殖和凋亡兩方面研究STAT3和SOCS3蛋白在中耳膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，從而進(jìn)一步探討中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制。

STAT蛋白是一種DNA 結(jié)合蛋白，激活后可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核啟動(dòng)下游靶基因轉(zhuǎn)錄，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)7個(gè)STAT 家族的成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。STAT3是STATs家族的重要成員，在JAK/STAT信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，其功能結(jié)構(gòu)主要包括：①SH2結(jié)構(gòu)域；②SH3結(jié)構(gòu)域；③酪氨酸磷酸化位點(diǎn)(Tyr 位點(diǎn))；④DNA結(jié)合區(qū)；⑤C末端、N末端[6]。細(xì)胞因子受體與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合并聚集STAT3，后者進(jìn)而在JAKs 的作用下實(shí)現(xiàn)磷酸化成為具有轉(zhuǎn)錄因子活性的p-STAT3。兩個(gè)P-STAT3分子形成同二聚體或異二聚體后，離開受體進(jìn)入細(xì)胞核，通過與下游靶基因相應(yīng)的啟動(dòng)子或特異性反應(yīng)原件結(jié)合，誘導(dǎo)與細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)的基因，如：c-Myc、 Bcl-2、CyclinD1、Bcl-xL、survivin等的表達(dá)[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，STAT3在中耳膽脂瘤上皮呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，在正常外耳道皮膚呈陰性或弱陽性表達(dá)，STAT3蛋白在中耳膽脂瘤上皮的表達(dá)異常增高(P<0.05)，由此推測(cè)STAT3在中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞活化后，啟動(dòng)細(xì)胞增殖和凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生促增殖和抗凋亡效應(yīng)。Friedland等[8]亦發(fā)現(xiàn)中耳膽脂瘤中存在IL-6受體IL-6R和gp130，且STAT3高表達(dá)與IL-6正相關(guān)，提示IL-6一方面上調(diào)STAT3蛋白表達(dá)，另一方面活化該蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用，而STAT3的高表達(dá)和活化可能促進(jìn)中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖和凋亡抑制。

SOCS3蛋白作為SOCS家族的重要成員，參與JAK/STAT3信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其激活依賴轉(zhuǎn)錄因子pSTAT3的啟動(dòng)。SOCS3蛋白的分子結(jié)構(gòu)主要包括氨基末端激酶抑制區(qū)域(kinase inhibitory region，KIR)、SH2機(jī)構(gòu)域和羧基末端SOCS盒[9]，其調(diào)控JAK/STAT3信號(hào)通路的可能機(jī)制包括：SOCS3可通過抑制JAK激酶的活性,阻斷STAT3的磷酸化，減少pSTAT3進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而減少下游VEGF、CyclinD1、c-myc、Bcl-2等靶基因的轉(zhuǎn)錄[10]；SOCS3分子上的SH2還可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞因子受體上的磷酸化酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)，直接阻礙STAT3磷酸化，進(jìn)而阻礙信號(hào)通路的進(jìn)一步轉(zhuǎn)導(dǎo)等[11]。本研究證實(shí)，SOCS3在正常外耳道皮膚組織呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，在膽脂瘤上皮中少量表達(dá)，SOCS3蛋白在膽脂瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)。由此推測(cè)SOCS3蛋白在膽脂瘤上皮中的低表達(dá)，一方面抑制JAK激酶活性能力降低，促進(jìn)STAT3蛋白活化；另一方面由于和細(xì)胞因子受體結(jié)合減少，增加了STAT3的活化，使活化STAT3進(jìn)入細(xì)胞核的量增加，從而啟動(dòng)細(xì)胞增殖相關(guān)基因。

生理?xiàng)l件下，JAK/STAT信號(hào)通路的激活快速而短暫，并受到SOCS的精密負(fù)反饋調(diào)節(jié)，來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。在正常外耳道皮膚中，STAT3蛋白的表達(dá)增加及活化會(huì)相應(yīng)地引起SOCS3蛋白的表達(dá)增多，受誘導(dǎo)表達(dá)的SOCS3再通過多種途徑來抑制STAT3蛋白的表達(dá)及JAK/STAT通路的進(jìn)一步活化，以維持外耳道皮膚正常的生理狀態(tài)。但在病理?xiàng)l件下或SOCS表達(dá)下調(diào)時(shí)，JAK/STAT通路呈過度激活狀態(tài)，引發(fā)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展[12]。研究表明，甲基化沉默SOCS3基因啟動(dòng)子，可使JAK/STAT3信號(hào)通路異常活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；而上調(diào)SOCS3蛋白表達(dá)水平，則可有效抑制JAK/STAT3信號(hào)通路，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)STAT3和SOCS3在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明SOCS3蛋白的缺乏或減少引起STAT3持續(xù)過度活化，可能引起中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞過度增殖和凋亡抑制，進(jìn)而參與中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，STAT3、SOCS3在中耳膽脂瘤上皮的異常表達(dá)，可能參與了中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞的過度增殖和凋亡抑制，為進(jìn)一步揭示中耳膽脂瘤的發(fā)病機(jī)制提供了依據(jù)；進(jìn)一步明確STAT3在膽脂瘤發(fā)生發(fā)展中的下游調(diào)控基因，上調(diào)SOCS3蛋白的表達(dá)可能對(duì)中耳膽脂瘤的預(yù)防和治療帶來新思路。

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(2015-11-02收稿)

(本文編輯周濤)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-2615：52

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20160426.1552.010.html

The Expression of STAT3 and SOCS3 Protein in the Middle Ear Cholesteatoma

Ye Fanglei, Li Meng, Li Shichao, Wang Le, Zhao Kun, Zhu Xiaodan, Zhang Ting

(Department of Otolaryngology, the First Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou, 450002, China)

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)and Suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3) in the middle ear cholesteatoma epithelium ,and the possible roles of STAT3 and SOCS3 in middle ear cholesteatoma.MethodsThe immunohistochemical assay was used to detect expression of STAT3 and SOCS3 protein in 30 cases of middle ear cholesteatoma epithelial tissue and 20 cases of normal external auditory canal skin tissues as the control group.ResultsSTAT3 immunoreactivity was detected in the nuclei and cytoplasm of epithelial cells. The expression rates of STAT3 in middle ear cholesteatoma epithelial tissue were 76.7% and higher than in the normal epithelium (25.0%). The differences between the two groups were statistically significant (P<0.05). SOCS3 immunoreactivity was detected in the cytoplasm of epithelial cells. The expression rates of SOCS3 in middle ear cholesteatoma epithelial tissue were 33.3% and lower than in the normal epithelium (65.0%). The differences were statistically significant (P<0.05). The expression of STAT3 and SOCS3 in the middle ear cholesteatoma had negative correlation (r=- 0.476,P<0.05).ConclusionThe abnormal expression of STAT3 and SOCS3 in the middle ear cholesteatoma may be involved in hyper proliferation and anti-apoptosis of cholesteatoma cell, and play an important role in the formation and development of middle ear cholesteatoma.

【Key words】Signal transducer and activator of transcription 3(STAT3)；Suppressor of cytokine signaling 3(SOCS3)；Cholesteatoma；Middle ear

【中圖分類號(hào)】R764.21

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1006-7299(2016)03-0265-04

DOI：10.3969/j.issn.1006-7299.2016.03.011

作者簡(jiǎn)介：葉放蕾，女，河南人，醫(yī)學(xué)博士，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槎@微外科、耳聾及耳鳴的防治。通訊作者：葉放蕾(Email：yefanglei000@sina.com)

1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科(鄭州450002)