李佳, 袁洪水, 王偉, 朱寶成

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 保定 071001

低氧條件適用性硅酸鹽細(xì)菌的分離及對水稻幼苗生長影響

李佳, 袁洪水, 王偉, 朱寶成*

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 保定 071001

從湖南地區(qū)水稻田土樣中分離適用于水田作物的硅酸鹽細(xì)菌, 得到在亞歷山大羅夫培養(yǎng)基上符合硅酸鹽細(xì)菌菌落特征的菌株1株, 編號為菌株s-3。通過一系列的生理生化試驗, 菌體形態(tài)及菌落特征的觀察以及16S rDNA序列分析對菌株s-3進(jìn)行菌種鑒定, 初步鑒定菌株s-3屬于硅酸鹽細(xì)菌的一種——環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)。通過在不同供氧條件下測定菌株s-3的解鉀能力, 發(fā)現(xiàn)在微氧條件下菌株s-3仍能保持較高的活性。通過水培試驗, 測定菌株s-3作為生物肥料對水稻植株幼苗的促生長能力, 發(fā)現(xiàn)施用菌株 s-3培養(yǎng)液后, 可大幅增加植株的鉀總量, 促進(jìn)植株生長, 具有作為生物肥料進(jìn)一步研究的潛力。

硅酸鹽細(xì)菌; 分離; 解鉀活性; 解磷活性

1 前言

土壤本身作為一個天然鉀庫, 其每公頃土壤耕作層中含鉀量約為 26100 kg, 而 90%—98%以上的鉀存在于正長石和云母等礦物中, 不能直接被植物吸收利用, 這就形成了土壤既富含鉀又缺鉀的現(xiàn)象[1-2]。

硅酸鹽細(xì)菌(Silicon bacteria)是指能分解硅酸鹽類礦物的細(xì)菌。目前硅酸鹽細(xì)菌主要有三種： 環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)、膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)和土壤芽孢桿菌(Bacillus edaphicus)[3-5]。2010年, 膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)和土壤芽孢桿菌(Bacillus edaphicus)又重歸類為膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)和土壤類芽孢桿菌(Paenibacillus edaphicus)。有報道表明, 硅酸鹽細(xì)菌具有分解土壤中含鉀礦物質(zhì), 活化鉀元素供作物吸收利用, 增加作物產(chǎn)量的能力[6-7]。因此, 在化肥污染嚴(yán)重的今天, 開發(fā)硅酸鹽細(xì)菌作為生物肥料來挖掘土壤中的鉀元素資源, 具有十分重要意義。

然而, 開發(fā)形成硅酸鹽菌劑產(chǎn)品作為生物肥料其功效往往因其施用的土壤環(huán)境不同而不同, 土壤環(huán)境不同, 尤其是水田和旱田溶氧量的不同會直接影響菌株在植株根系區(qū)域的定植、生長、繁殖狀態(tài)以及與土壤周圍環(huán)境的相互作用, 從而進(jìn)一步影響菌劑型生物肥料的作用效果。但是目前市售的相關(guān)硅酸鹽菌劑產(chǎn)品中, 并沒有考慮到這一點, 也未見有針對性產(chǎn)品銷售[8]。

本文對從湖南地區(qū)水稻田土壤中分離得到的符合硅酸鹽細(xì)菌菌落特征的菌株 s-3通過形態(tài)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析進(jìn)行了初步鑒定, 并在不同供氧條件下對其解鉀能力進(jìn)行了初步研究, 同時通過水培試驗, 測定菌株s-3作為生物肥料為水稻提供鉀養(yǎng)分, 促進(jìn)水稻植株幼苗生長的能力, 為其作為生物肥料用于水田作物奠定一定的理論基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 試驗樣品

土壤樣品來源： 湖南省婁底市水稻田土壤;

對照菌株： 從商品化的生物鉀肥中分離的硅酸鹽細(xì)菌菌株k-7。

水稻種子： 春光 1 號, 購于四川省南充市某種子公司。

2.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基： MgSO4·7H2O 2.0 g, FeCl30.2 g, CaCO31.0 g, 蔗糖 2.0 g, 淀粉 7.0 g, 硫銨 0.5 g, K2HPO42.0 g, 酵母膏 0.8 g, 豆餅粉 0.7 g, pH 7.0,蒸餾水 1 000 mL。

亞歷山大羅夫培養(yǎng)基見《微生物實驗指導(dǎo)》[9]。

生理生化試驗所用培養(yǎng)基見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]。

2.3 主要試劑

生理生化試驗所用試劑見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]。

耗氧劑： 還原性鐵粉1.0 g、低亞硫酸鈉5.0 g、碳酸氫鈉5.0 g、水2.2 mL。用于容積為1 L的空間。

2.4 試驗方法

2.4.1 土壤樣品的采集

采用常規(guī)土壤樣品取樣法[9], 取土樣于牛皮紙袋中, 風(fēng)干并記錄采樣信息。

2.4.2 硅酸鹽菌株的分離

取1.0 g土壤樣品, 采用常規(guī)的梯度稀釋涂布平板法[9]獲得一系列土壤樣品稀釋液, 取適宜梯度土壤樣品稀釋液各0.5 mL涂布亞歷山大羅夫培養(yǎng)基平板, 于置有足量耗氧劑的環(huán)境中, 28 ℃培養(yǎng)5 d。之后對比典型硅酸鹽細(xì)菌菌落特征, 挑選菌落特征吻合的菌株, 接種亞歷山大羅夫培養(yǎng)基, 28 ℃培養(yǎng)5 d,同時, 將所選菌株進(jìn)行劃線驗純, 選擇純菌株保存于4℃冰箱。

2.4.3 菌株s-3的形態(tài)觀察

刮取少量菌株 s-3的菌體細(xì)胞采用常規(guī)的梯度稀釋涂布平板法[9]得到適宜濃度梯度的菌體懸液涂布亞歷山大羅夫培養(yǎng)基平板, 于置有足量耗氧劑的環(huán)境中, 28 ℃培養(yǎng)5 d。獲得單菌落進(jìn)行觀察。采用常規(guī)方法[10]取菌株 s-3的菌體細(xì)胞進(jìn)行革蘭氏染色并觀察其菌體形態(tài)

2.4.4 基因組DNA的提取及16S rDNA的擴增純化

試驗于2014—2015年在靖遠(yuǎn)縣永新鄉(xiāng)野生甘草撫育基地進(jìn)行。該地區(qū)屬暖溫帶大陸性氣候，海拔2 039 m，位于東經(jīng) 104°35′35.1″、北緯 37°04′16.5″，干旱少雨，風(fēng)大沙多，植被稀少，年降雨量200 mm左右，主要集中在7—9月，蒸發(fā)量在2 179.8 mm，年平均氣溫在8.5℃，大于10℃的積溫2 944℃，年平均風(fēng)速2.6 m/s，大風(fēng)天數(shù)為50～90 d，絕對無霜期128 d。

將菌株s-3接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期,取適量培養(yǎng)液采用 CTAB法[8]提取基因組 DNA, -20 ℃保存。以瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量并進(jìn)行16S rDNA序列擴增。

PCR條件為： 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s,57 ℃退火40 s, 72 ℃延伸90 s, 共32個循環(huán); 最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物純化后送華大基因工程有限公司測序。

2.4.5 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將測定的菌株s-3的16S rDNA基因序列輸入GenBank中, 與其中原核生物各種屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA基因序列比對, 根據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并計算菌株s-3與相關(guān)建樹菌株16S rDNA基因序列之間的相似性。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用phylip軟件包。重建系統(tǒng)發(fā)育樹采用Treeview軟件[11]。

2.4.6 菌株的生理生化測定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中相應(yīng)屬、種鑒定有關(guān)的內(nèi)容, 共進(jìn)行了菌株厭氧性測定、V.P試驗、酪素水解、硝酸鹽還原、卵磷脂酶試驗、吲哚試驗、檸檬酸鹽、甲基紅、苯丙氨酸脫氨酶、淀粉水解、過氧化氫酶、葡萄糖、甘露醇等發(fā)酵試驗、脲酶、明膠液化等生理生化試驗, 具體方法見《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[10]。

2.4.7 在不同溶氧發(fā)酵條件下菌株解鉀活性的測定

發(fā)酵分三組： 第一組以透氣膜封口, 上搖床發(fā)酵(180 r·min-1); 第二組以透氣膜封口, 靜止發(fā)酵; 第三組以不透氣的塑料膜封口, 加耗氧劑靜止發(fā)酵。

在無鉀發(fā)酵培養(yǎng)液中加入終濃度為 1.0 g·mL-1的鉀鋁酸鹽, 接種供試菌株 s-3, 分別在不同供氧條件下進(jìn)行發(fā)酵, 每項三個平行, 培養(yǎng)48 h, 得到發(fā)酵液, 利用原子吸收分光光度法測定發(fā)酵液中水溶性鉀含量, 在半小時內(nèi)比濁完畢, 同時作空白實驗。

2.4.8 菌株s-3水培試驗

以春光 1號水稻為供試種子, 采用常規(guī)水培方式測定菌株 s-3作為生物鉀肥對水稻幼苗生長的影響。實驗組使用量0.5 mL發(fā)酵液/粒種子, 對照組：0.5 mL蒸餾水/粒種子, 實驗設(shè)計3個重復(fù), 每個重復(fù)三個平行, 每個平行20粒種子。觀察記載培養(yǎng)30 d后處理和對照上述供試作物的株高、最大葉長、最大葉寬、假莖寬、根數(shù)、白根數(shù)、根長、鮮重和干重,并以四苯硼鈉比濁法測定植株中鉀養(yǎng)分的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 硅酸鹽細(xì)菌的分離純化

從水稻田土樣分離得到符合硅酸鹽細(xì)菌菌落形態(tài)特征的細(xì)菌菌株1株, 編號為： s-3。

3.2 菌落形態(tài)觀察

供試菌株 s-3單菌落為圓形凸起、邊緣完整、表面濕潤光滑、無色透明的大型菌落, 像半粒玻璃珠平貼于平板上, 菌落粘稠, 富有彈性, 挑起時能拉成很長的絲。符合典型的硅酸鹽細(xì)菌的單菌落特征, 單菌落形態(tài)見圖1。

3.3 菌體特征觀察

供試菌株 s-3經(jīng)革蘭氏染色在顯微鏡下觀察呈陽性, 菌體呈桿狀, 兩端鈍圓, 長約2.5 μm, 直徑約0.7 μm, 芽孢次端生。

3.4 16S rDNA序列分析

測定菌株s-3的16S rDNA基因序列, 將該序列輸入GenBank中, 與其中原核生物各種屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株 16S rDNA基因序列比對, 根據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)并計算菌株s-3與相關(guān)建樹菌株16S rDNA基因序列之間的相似性(表1)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹采用phylip軟件包。

由試驗結(jié)果可知, 供試菌株s-3的16S rDNA序列和與之參比的芽孢桿菌屬相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株同源相似度大部分在98%以上, 因此可初步判斷菌株s-3屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)。

3.5 菌株的生理生化測定

生理生化試驗結(jié)果見表2。

供試菌株s-3為化能異養(yǎng)細(xì)菌, 能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇等多種碳源; 最適生長溫度為 28℃左右, 最適生長pH 6.8—7.0左右。

通過對供試菌株 s-3的菌落形態(tài)、菌體特征的觀察, 16S rDNA序列分析以及生理生化特征測定,根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊》[10]和相關(guān)文獻(xiàn)中有關(guān)種、屬鑒定的相關(guān)內(nèi)容, 初步鑒定供試菌株s-3為環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans), 屬于硅酸鹽細(xì)菌的一種。

圖1 菌株s-3單菌落形態(tài)Fig. 1 Single colonial morphology of strain s-3

圖2 依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的菌株s-3及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Neighbour-joining tree based on 16S rDNA sequences showing relationship between strain s-3 and related strains

表1 菌株s-3與參比菌株的16S rDNA序列相似性Tab. 1 Similarity of the sequences of 16S rDNA between strain s-3 and reference strains

表2 菌株s-3的生理生化特征Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics of strain s-3

3.6 在不同溶氧發(fā)酵條件下菌株的解鉀活性

以透光度為縱坐標(biāo), 鉀標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為橫坐標(biāo), 繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線, 得到回歸方程： Y=0.1209x—0.1451; R=0.9896。

在不同溶氧發(fā)酵條件下進(jìn)行發(fā)酵, 測定對照菌株 k-7及供試菌株 s-3的解鉀活性, 每項三個平行,取平均值。根據(jù)待測液透光度的平均值, 即可從回歸方程中算得相應(yīng)的鉀元素含量(結(jié)果見表3)。

將上述實驗中測定的不同溶氧發(fā)酵條件下對照菌株k-7和供試菌株s-3的解鉀量進(jìn)行成對雙樣本均值分析t—檢驗, 結(jié)果表明： P＜0.05, 即對照菌株k-7顯著低于供試菌株s-3。尤其是, 當(dāng)供氧條件發(fā)生變化時, 與對照菌株k-7相比, 供試菌株s-3表現(xiàn)出的解鉀活性受到的影響較小, 當(dāng)發(fā)酵體系中溶氧下降,溶氧濃度相對較低時, 對照菌株 k-7的解鉀活性下降了超過50%, 而菌株s-3的解鉀活性仍能保持原水平的 95%左右。可見, 由水田土壤分離得到的硅酸鹽細(xì)菌菌株 s-3在水田等溶氧濃度相對較低的環(huán)境下, 仍可能具有較高的溶解環(huán)境中不溶的鉀元素的能力, 使鉀元素更易被作物吸收利用, 因而具有進(jìn)一步研究開發(fā)作為生物鉀肥施用于水田作物的較大潛力。

3.7 菌株s-3水培試驗

以春光 1號水稻為供試種子, 采用常規(guī)水培方式培養(yǎng)30 d, 觀察記載培養(yǎng)30 d后處理和對照上述供試作物的株高、最大葉長、最大葉寬、假莖寬、根數(shù)、白根數(shù)、根長、鮮重、干重和鉀含量(表4)。

從表4看出, 水稻配施菌株s-3發(fā)酵液后, 植株的株高、最大葉長、最大葉寬、假莖寬、根數(shù)、白根數(shù)、根長、鮮重、干重和鉀含量均高于對照。相對于對照組來說, 實驗組植株內(nèi)鉀含量平均增加了17.31%, 株高、最大葉長、最大葉寬、假莖寬、根數(shù)、白根數(shù)、根長、鮮重和干重則分別提高了 17.31%、16.56%、22.52%、17.17%、3.42%、20.08%、26.16%、7.36%、29.81%、36.66%。將以上水稻農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行成對雙樣本均值分析 t—檢驗可知： 實驗組植株內(nèi)鉀含量及其他農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)均顯著高于對照組(P＜0.05)。由此可見, 施用菌株s-3培養(yǎng)液可顯著促進(jìn)水稻植株生長發(fā)育, 提高植株內(nèi)鉀含量, 明顯增加植株鉀養(yǎng)分含量。因此, 菌株s-3應(yīng)具作為生物肥料用于水田作物種植的潛力, 有進(jìn)一步研究的價值。

表3 不同溶氧發(fā)酵條件下菌株s-3和k-7的解鉀活性Tab. 3 Activity of releasing potassium of strain s-3 and strain k-7 on different level of oxygen dissolution

表4 水稻農(nóng)藝性狀比較Tab. 4 Comparison of Agronomic characters of different rice plants

4 討論

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中, 種植農(nóng)作物時常常需大量鉀元素來提高農(nóng)作物的產(chǎn)量。土壤本身作為一個天然鉀庫,其每公頃土壤耕作層中含鉀量約為 26100 kg, 但是90%—98%以上的鉀存在于正長石和云母等礦物中,很穩(wěn)定, 不能直接被植物吸收利用, 這就形成了土壤既富含鉀又缺鉀的現(xiàn)象[4,12-14]。硅酸鹽細(xì)菌具有分解土壤中含鉀礦物質(zhì), 釋放鉀元素的能力, 可將土壤中不能直接被植物吸收利用的鉀元素轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的可溶性鉀, 增加作物產(chǎn)量。因此, 硅酸鹽細(xì)菌作為土壤中的一類重要的功能菌, 將其開發(fā)作為生物肥料來轉(zhuǎn)化利用土壤中的鉀元素等資源,這對發(fā)展生態(tài)、經(jīng)濟農(nóng)業(yè)具有十分重要意義[2,5,15-16]。

目前在生物肥料的應(yīng)用中存在一些普遍的問題：硅酸鹽菌劑作為一種微生物肥料, 其功能的有效發(fā)揮必須滿足兩個基本條件： 一是菌株的高效性, 二是菌株本身對不同作物及土壤環(huán)境的適應(yīng)性[17-20]。自然環(huán)境中水田和旱田的溶氧條件不同, 通常水田中氧含量較低, 并且會明顯低于旱田中氧含量。但是目前市售的相關(guān)硅酸鹽菌劑產(chǎn)品中, 并未有針對性產(chǎn)品出現(xiàn), 例如針對水田低氧環(huán)境的產(chǎn)品并未見有銷售, 在相關(guān)研究報道中, 該方面的應(yīng)用研究亦不多見[8]。本文以水田土壤為樣品, 從中分離的硅酸鹽細(xì)菌菌株 s-3, 相對于對照菌株 k-7來說, 具有較高的解鉀活性, 同時, 菌株s-3對水田土壤環(huán)境, 尤其是微氧環(huán)境的適應(yīng)能力亦較強, 在此環(huán)境下, 菌株s-3可保持較高解鉀活性, 另外, 以春光1號水稻為供試種子, 采用常規(guī)水培方式測定了菌株 s-3作為生物鉀肥對水稻幼苗生長的影響, 有實驗結(jié)果可以看出施用菌株 s-3培養(yǎng)液后, 水稻幼苗鉀總量大幅增加, 植株的株高、最大葉長、最大葉寬、假莖寬、根數(shù)、白根數(shù)、根長、鮮重和干重亦均高于對照組植株, 可見菌株 s-3確實具有作為生物鉀肥促進(jìn)水稻等水田作物生長的潛力。因此, 菌株s-3作為生物肥料用于水田作物種植的可行性較大, 應(yīng)具有作為水田作物生物肥料進(jìn)一步研究的價值。

而將菌株 s-3開發(fā)為生物肥料用于水田作物種植, 若要其發(fā)揮較好的肥效則還需進(jìn)一步探索適宜的菌劑工業(yè)化生產(chǎn)工藝, 并研究該菌劑在不同作物的植株根系區(qū)域的定植、生長、繁殖狀態(tài)以及與土壤周圍環(huán)境的相互作用, 探索適宜的菌肥產(chǎn)品施用方法、施用時期及施用量。

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Isolation of silicate bacteria from paddy field and determination of activity of the strain

LI Jia, YUAN Hongshui, WANG Wei, ZHU Baocheng*
College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China

From the soil samples of paddy field in Hunan area, several silicated bacteria strains had been isolated, which could be used as a kind of biological fertilize applied to paddy-field. As a result, a strain named s-3 which was similar to the silicate bacteria was obtained. Then the strain was identified by morphological and culture features observation, a series of physiological and biochemical experiments and 16S rDNA sequence analysis. Based on the results, strain s-3 was identified as Bacillus circulans, a kind of silicate bacteria. The ability of strain s-3 to release potassium at different levels of oxygen dissolution was determined. As a result, we found that on the condition of low oxygen dissolution, strain s-3 still had a certain level of activity of releasing potassium. And then the activities of strain s-3 as a biological fertilizer to release potassium nutrient and to promote rice growth were determined through hydroponic experiment. As a result, we found that the culture fluid of strain s-3 had a certain level of activity to increase the content of K in rice and promote rice growth, which indicated its potential as a bio-fertilizer.

silicate bacteria; isolation; activity of releasing potassium and phosphorus

10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.016

Q93

A

1008-8873(2016)01-103-06

2014-12-27;

2015-02-13

膠凍樣類芽孢桿菌肥料制劑生產(chǎn)工藝及其應(yīng)用

李佳(1982—), 女, 山西, 講師, 碩士, 研究方向為農(nóng)牧微生物學(xué), E-mail： qilan82@126.com*通信作者：朱寶成, 教授, 博士研究生導(dǎo)師, 主要從事農(nóng)牧微生物學(xué)研究

李佳, 袁洪水, 王偉, 等. 低氧條件適用性硅酸鹽細(xì)菌的分離及對水稻幼苗生長影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2016, 35(1)： 103-108.

LI Jia, YUAN Hongshui, WANG Wei, et al. Isolation of silicate bacteria from paddy field and determination of activity of the strain[J]. Ecological Science, 2016, 35(1)： 103-108.