何 昊，許 暢，王興中，蘇 力，張家旭

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

黃芪(Astragali Radix)為豆科植物蒙古黃芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。黃芪中含有皂苷、黃酮、多糖等多類化合物，其中黃芪甲苷Astragaloside IV是黃芪中皂苷的主要成分[2]，也是其重要的生理活性成分，具有增強(qiáng)免疫力，消炎、降壓、抗病毒、抗衰老、清除自由基等功效[3]。毛蕊異黃酮能夠提高機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，具有抗輻射、抗癌作用，能舒張血管平滑肌，保護(hù)心腦血管，還能保護(hù)腦細(xì)胞、提高記憶力，另具有激素樣作用，可減少糖尿病并發(fā)癥等[4]。因此，黃芪藥材及多種制劑均以黃芪甲苷和毛蕊異黃酮為定性或定量指標(biāo)成分。然而，黃芪中黃芪甲苷的含量并不高，因此需要選擇一種高效便利的提取工藝，為黃芪甲苷的提取提供便利。煎煮法、滲漉法均為傳統(tǒng)提取方法，特點(diǎn)為提取時間長，成本低；索氏提取法是連續(xù)回流提取法的一種，提取效率較高；CO2超臨界流體提取法是在高壓下CO2處于超臨界狀態(tài)而提取有效物質(zhì)的一種技術(shù)，可以在接近室溫下進(jìn)行提取，具有無有機(jī)殘留，無公害，分離簡單等特點(diǎn)。

作者分別采用煎煮法、滲漉法、索氏提取法和CO2超臨界流體提取法對黃芪中黃芪甲苷成分進(jìn)行提取，比較提取條件、浸膏得率及黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時選擇毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比參照，最終結(jié)果為選擇適當(dāng)?shù)狞S芪甲苷提取方法提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

黃芪：購于西安市萬壽路藥材市場，經(jīng)鑒定為膜莢黃芪Asrtagalusmembranaceus(Fisch.) Bge.。藥材干燥、粉碎，過篩(篩孔尺寸：0.425 mm)后保存；黃芪甲苷對照品、毛蕊異黃酮對照品：質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，上海源葉生物科技有限公司；乙醇、正丁醇：分析純，乙腈：色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；濃氨溶液：分析純，西安化學(xué)試劑廠；純凈水：廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

Waters1525高效液相色譜儀：美國Waters公司；Alltech ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器：美國Alltech公司；FW200A高速萬能粉碎機(jī)：北京科偉永興儀器有限公司；MH-500型調(diào)溫電熱套：北京科偉永興儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-D Ⅲ型循環(huán)水真空泵：鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；GR-202分析電子天平：日本AND公司；Thermo Micropure超純水儀：賽默飛世爾科技；SFT-100XW型超臨界萃取儀：美國Supercritical Fluid Technologie；滲漉柱:30 mm×300 mm、索氏提取器：500 mL,北京博美華科玻璃有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液配制

精密稱取黃芪甲苷和毛蕊異黃酮對照品，甲醇溶解制成0.5 mg/ mL的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的配制

煎煮法：稱取黃芪藥材粉末20 g，加入20倍量純凈水，持續(xù)煎煮2 h，過濾，減壓濃縮至干。滲漉法：稱取黃芪藥材20 g，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇潤濕，裝入滲漉柱中，浸漬24 h，之后以0.3 mL/min速度滲漉提取，收集8倍量的滲濾液，減壓濃縮至干。索氏提取法：稱取黃芪藥材粉末20 g，用濾紙包裹好，置入索氏提取器中，加入200 mL體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，回流提取4 h，減壓回收溶劑至干。CO2超臨界流體提取法：稱取黃芪藥材20 g，加入超臨界萃取釜中，參數(shù)為壓力40 MPa，萃取溫度45 ℃，夾帶劑為無水乙醇，靜態(tài)萃取40 min，動態(tài)萃取30 min，CO2流速10 L/h，所得提取物留待HPLC檢測。以上4種方法所得提取物均加水微熱使其溶解，用水飽和正丁醇振搖萃取4次，每次200 mL，合并正丁醇，之后用氨試液(濃氨溶液400 mL，加水至1 000 mL即得)洗滌2次，每次200 mL，之后蒸干正丁醇。

1.2.3 液相色譜分析條件

色譜柱Kromasil C18分析柱(4.6 mm×150 mm)；流動相：V(乙腈)∶V(水)(0 min，0∶100；0～4 min，20∶80；4～8 min，40∶60；8～12 min，60∶40；12～16 min，80∶20；16～20 min，100∶0；梯度洗脫)；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；ELSD檢測器；進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-ELSD法同時測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 色譜條件的選擇

由于黃芪甲苷僅在201 nm附近有末端吸收，因此采用紫外檢測器導(dǎo)致噪音較大、重現(xiàn)性差。故實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法同時對黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定[5]。

采用HPLC-ELSD方法，以Kromasil Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱；乙腈和水為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min；蒸發(fā)光散射檢測器，ELSD 參數(shù)：漂移管溫度95 ℃，載氣流速2.1 L/min。

2.1.2 液相色譜分析專屬性實(shí)驗(yàn)

按照上述色譜條件，對標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行混合進(jìn)樣測定分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

t/mina 黃芪甲苷和毛蕊異黃酮對照品

t/minb 黃芪藥材供試品圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC-ELSD圖譜

以上結(jié)果證明該方法專屬性好。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置于10 mL容量瓶中，加入定量甲醇稀釋至刻度，按2.1.1的色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，測定峰面積。分別以各組分的峰面積(y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如下。

回歸方程：y=87.776x-0.188 6(r=0.999 2，n=6)。

以上結(jié)果證明線性關(guān)系良好。

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取黃芪浸膏粉，按1.2.2制備樣品溶液，在2.1.1色譜條件下測定，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次20 μL，測得黃芪甲苷和毛蕊異黃酮色譜峰面積的RSD分別為2.7%和3.1%，見表1。表明該方法的精密度良好。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取黃芪浸膏粉末，按1.2.2制備樣品溶液，分別于0，2，4，8，12 h測定，測定黃芪甲苷和毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.6%和2.1%，見表2。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn)

取黃芪浸膏粉末，分別加入對照品溶液6.0，4.0，2.0 mL，按1.2.2制備樣品溶液，在2.2.1色譜條件下，進(jìn)樣20 μL。每個樣品重復(fù)3次，計算平均回收率，結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 四種不同提取方法質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定及結(jié)果

采用煎煮法、索氏提取法、滲漉法和CO2超臨界流體提取法4種不同的方法對黃芪藥材進(jìn)行提取，以干浸膏得率、黃芪甲苷得率、毛蕊異黃酮得率、提取時間、成本等多方面進(jìn)行綜合比較，結(jié)果見表4。

由表4可看出，CO2超臨界流體提取法對于黃芪甲苷和毛蕊異黃酮提取率均最高，提取時間最短，但設(shè)備成本較高。

表4 四種不同提取方法的綜合比較

3 結(jié) 論

同時選用浸膏得率、黃芪甲苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)和毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為觀測指標(biāo)，可綜合考察各提取方法對黃芪中主要指標(biāo)成分的提取效率，對于提取方法的選擇更具有參考性。綜合比較4種提取方法提取黃芪中黃芪甲苷的提取效率，以干浸膏得率以及黃芪甲苷和毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為標(biāo)準(zhǔn)，得出CO2超臨界流體提取法提取時間最短，提取效率最高，是一種簡便、快速，值得推廣的提取方法，但是，CO2超臨界流體提取法設(shè)備成本較高，這也是推廣過程中需要注意的一點(diǎn)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2015版(一部)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：302-303.

[2] Bian Y Y,Guan J,Bi Z M,et al.Studies on chemical constituents ofAstragalusmembranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.) Hsiao[J].China Pharm J,2006,41(16):1217-1221.

[3] 段立軍，孫博航.黃芪甲苷的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2011，28(5):410-416.

[4] 張冬青，王海寶，王淑芳，等.毛蕊異黃酮生物活性的研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志,2015,40(22):4339-4345.

[5] 宋成英，封加福.HPLC同時測定黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(11):115-117.