姜蘇峻，林蔣海，呂曉靜，肖文娟，龔映雪，劉澤寰

(暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州510632)

米根霉脂肪酶的制備及其在餐廚廢棄油脂轉化中的應用*

姜蘇峻，林蔣海，呂曉靜，肖文娟，龔映雪，劉澤寰

(暨南大學生命科學技術學院，廣東 廣州510632)

利用脂肪酶把餐廚廢棄油脂轉化成為生物柴油能夠達到綠色化、資源化處理餐廚垃圾的目的。從米根霉CICC3005 cDNA文庫擴增得到脂肪酶基因(proROL)，并克隆到畢赤酵母組成型表達載體pGAPZαA中，電轉入畢赤酵母X-33中構建重組畢赤酵母，SDS-PAGE電泳發(fā)酵液上清，結果顯示重組酶的相對分子質量約為35 000。以橄欖油為底物測得脂肪酶活性為(426.6±0.8) U/mL。利用重組的米根霉脂肪酶對餐廚廢棄油脂進行轉酯化反應，以乙醇為?；荏w制備脂肪酸乙酯，在水含量為5%，醇油摩爾比為4∶1，酶添加量為10%的條件下得到脂肪酸乙酯的最高得率為49%。

餐廚廢棄物；生物柴油；米根霉；脂肪酶；畢赤酵母

隨著我國城鎮(zhèn)化建設步伐的日益加快，城市垃圾的產生量和危害也日益增加，其中尤以餐廚垃圾最為凸顯[1]。 “地溝油”就是從餐廚垃圾中的廢棄油脂提煉而來的。而且餐廚廢棄油脂占餐廚垃圾的比重還相當的高[2]，如能合理利用，非但可以消除其對人們健康生活的危害，還能變廢為寶，生產大量的工業(yè)用油或生物柴油造福人類[3]。

利用餐廚廢棄油脂生產生物柴油目前多采用化學法[4]，化學法存在工藝復雜，醇消耗量大，污染環(huán)境等缺點。而酶法生產生物柴油具有操作簡單，醇消耗量小，無污染物排放等優(yōu)點。但是傳統(tǒng)酶法工藝一般以毒性較大的甲醇為酰基受體，加工過程中仍然存在污染較大的隱患。

脂肪酶是一種能夠在油水界面起催化作用[5]，催化甘油三酯進行轉酯化反應[6]和酯化反應[7]的特殊酯酶，在生產生物柴油、手性大分子以及表面活性劑[8]領域中具有重要的應用價值。因此通過基因工程技術實現脂肪酶的外源高效表達對于合理利用餐廚廢棄油脂具有重要意義。米根霉來源的脂肪酶是一種比酶活較高的酯酶，在轉酯化反應方面有較好的表現[9]。該酶的編碼基因包括26個氨基酸殘基的信號序列(presequence)，97個殘基的前導肽序列(prosequsence)和 269個氨基酸殘基的成熟肽序列(matureROL)，其中前導肽序列對脂肪酶的活性起到重要作用[10-11]。

本文從米根霉CICC3005菌株中克隆得到了脂肪酶基因，在畢赤酵母X-33中實現了高效表達，選取毒性較低的乙醇替代傳統(tǒng)?；荏w甲醇，以重組酵母生產的脂肪酶為催化劑進行轉酯化反應生產生物柴油，從而達到降低催化劑的生產成本，減少對環(huán)境破壞的目的。

1 材料和方法

1.1 質粒與菌株

載體pGAPZαA、大腸桿菌Escherichiacoli(E.coli) DH5α 菌株、米根霉RhizopusoryzaeCICC 3005菌株。

畢赤酵母P.pastorisX33菌株由中國廣東省廣州市華南理工大學某實驗室饋贈。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

含有zeocin和Amp抗性的LB培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、含有zeocin抗性的YPD培養(yǎng)基分別用以培養(yǎng)大腸桿菌、米根霉和酵母菌。

1.3 米根霉總RNA的提取以及cDNA文庫的構建

米根霉總RNA的提取按照Invitrogen公司的TRIzol?Reagent說明書進行操作；反轉錄與cDNA文庫的構建按照ReverTra Ace-α-試劑盒說明書進行。然后根據Genebank公布的米根霉基因序列(GenBank登錄號AF229435)設計引物擴增脂肪酶基因，上游引物：5′-GAATTCGTTCCTGTTTCTGGTAAATC-3′;下游引物：5′-TCTAGAGCCAAACAGCTTCCTTCGTT-3′。

1.4 重組畢赤酵母的構建與鑒定

將經過測序的proROL序列克隆到pMD18-T中，得到pMD18-T-proROL。利用EcoR Ⅰ和XbaⅠ同時雙酶切pMD18-T-proROL和pGAPZαA載體，并在T4 DNA 連接酶作用下構建pGAPZαA-proROL重組質粒，用BlnⅠ線性化后電轉入畢赤酵母X-33構建重組菌，最后通過菌落PCR、SDS-PAGE和三丁酸甘油酯-維多利亞藍平板[12-13]鑒定陽性克隆并篩選高產菌株。

1.5 重組酵母發(fā)酵及酶活測定

將鑒定得到的重組酵母接種到含有zeocin抗性的YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后按照1%的接種量接種到含有100 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，用于重組酵母發(fā)酵以及酶活測定，在酶活最高點時收集粗酶液，凍干后低溫儲存?zhèn)溆?。脂肪酶酶活測定采用橄欖油乳化法[14]，脂肪酶酶活計算公式：

X1—脂肪酶酶活(U/mL)

V1—滴定樣品消耗氫氧化鈉標準液的體積(mL)

V2—滴定空白消耗氫氧化鈉標準液的體積(mL)

C—標準氫氧化鈉滴定液濃度(mol/L)

50—1 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉相當于脂肪酸50 μmoL

n1—酶液稀釋倍數

0.05—氫氧化鈉標準滴定液濃度

1/15—反應時間為15 min，以1 min計。

1.6 脂肪酶酶學特性分析

脂肪酶酶學特性分析采用對硝基苯酚法[16-18]：配置10 mL 10 mmol/L的pNPC底物溶液：稱量24.23 μL pNPC溶于10 mL乙腈溶液。將以上底物溶液、乙醇、Tris-cl(pH 8.0)按照1∶4∶95(體積比)的比例混勻，然后取240 μL，加入適當稀釋的酶液10 μL，于37 ℃水浴中準確反映10 min，用酶標儀測定405 nm下的吸光值，根據pNP標準曲線計算脂肪酶的pNP酶活。脂肪酶酶活定義為每分鐘釋放1 μmoL pNP所需要的酶量。分別研究了溫度、pH、有機溶劑，以及脂肪酶的底物特異性[18]。

1.7 油脂提取和以無水乙醇為?；荏w的轉酯化反應

首先通過索氏提取法提取餐廚廢棄物中的廢棄油脂[19]，測得餐廚廢棄油脂的酸值為(2.89±0.5) mg/g，皂化值為(199.94±0.8) mg/g，其平均摩爾質量為(854.1±0.8) g/mol。然后將2 g餐廚廢棄油脂和不同醇油摩爾比下的無水乙醇在25 mL帶帽血清瓶中進行轉酯化反應：實驗中采取3步(0，4，8 h)添加乙醇的方法來減少乙醇對脂肪酶酶活的損害。轉酯化反應溫度為40 ℃，轉速為300 r/min。反應結束后采用氣相色譜法計算生成生物柴油的量[20]。

2 結果和討論

2.1 重組畢赤酵母的構建

用PCR方法擴增得到RhizopusoryzaeCICC 3005的米根霉脂肪酶基因，連接T載后測序，測序結果顯示沒有發(fā)生突變。瓊脂糖電泳結果顯示，在1 100 bp處有明顯亮帶，表明成功克隆得到了米根霉脂肪酶基因，電泳結果如圖1所示。

圖1 米根霉RNA提取(A)和proROL(b)基因的擴增Fig.1 RNA of Rhizopus oryzae(A)and proROL gene(B)

2.2 菌落PCR鑒定pGAPZαA-proROL陽性轉化子

從含有博來霉素抗性的YPD平板挑取8個單克隆做菌落PCR，如圖2所示。挑取1,2,11,12,13號單克隆進行活化，4 ℃離心獲得粗酶液，取30 μL點到三丁酸甘油酯-維多利亞藍平板上觀察水解圈，13號水解圈最大，如圖3。后續(xù)實驗采用13號重組子。

圖2 菌落PCR鑒定重組畢赤酵母Fig.2 Colony PCR of recombinant Pichia pastoris

圖3 三丁酸甘油酯-維多利亞藍平板水解圈Fig.3 Colour halos of Tributyrin-Victoria Blue

2.3 重組米根霉脂肪酶酶活曲線及生長曲線

選取顯色平板中水解圈最大的13號重組子進行發(fā)酵培養(yǎng)，并采用橄欖油乳化法測定重組脂肪酶酶活，在84 h(A600為30.0)的時候酶活達到最高值(426.6±0.8) U/mL，如圖4。對發(fā)酵液上清進行SDS-PAGE分析，顯示在理論值35 000附近存在明顯條帶，如圖5，表明米根霉脂肪酶在畢赤酵母中成功獲得了表達。

圖4 重組米根霉脂肪酶的酶活曲線及生長曲線Fig.4 Time course analysis of recombinant proROL activities and biomass of recombinant Pichia pastoris

圖5 重組脂肪酶SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant lipase proROL

2.4 重組米根霉脂肪酶酶學特性分析

2.4.1 溫度和pH對重組脂肪酶的影響 如圖6和圖7所示，重組脂肪酶最適溫度和pH分別是30 ℃和pH 8.0,這與嚴翔翔[21]得出的結果一致。在溫度大于40 ℃后，酶活迅速下降，說明重組脂肪酶對溫度敏感。在pH 大于8.0后，酶活有所下降，但不明顯，表現出較強的pH耐受性。

圖6 溫度對重組脂肪酶的影響Fig.6 Influence of temperature on recombinant proROL

圖7 pH對重組脂肪酶的影響Fig.7 Influence of pH on recombinant proROL

2.4.2 有機溶劑對重組脂肪酶酶活的影響 從圖8可以看出，重組脂肪酶僅對甲醇、甲苯和正己烷有較好的耐受性，其相對酶活分別為87.70%、91.30%和89.40%。考慮到后續(xù)實驗以乙醇為?；荏w，我們又研究了不同體積分數的乙醇對脂肪酶酶活的影響。當無水乙醇和脂肪酶粗酶液體積比為1∶9，即乙醇體積分數約為4%時，對脂肪酶酶活的抑制作用較小，如圖9。

圖8 有機溶劑對重組脂肪酶的影響Fig.8 Influence of organic solvents on recombinant proROL

圖9 不同φ(乙醇)對重組脂肪酶的影響Fig.9 Influence of different concentrations of ethanol on recombinant proROL

2.4.3 proROL的底物特異性分析 從圖10可以看出，若設定圖10：14C底物與重組脂肪酶反應時的酶活為100%，那么重組脂肪酶對圖10：8C底物的水解活性為85.20%，對圖10：8C-14C中長度碳鏈底物表現出較好的水解活性，而對其他碳鏈長度的底物水解活性較低。

圖10 重組脂肪酶底物特異性Fig.10 Substrate specificity of recombinant ProROL

2.5 以乙醇為酰基受體的轉酯化反應

2.5.1 水含量對轉酯化反應的影響 脂肪酶是一種在油水界面起催化作用的特殊酯酶，因此需要一定量的水分來輔助轉酯化反應。從圖11可以看出，將脂肪酶凍干粉用于轉酯化反應，在沒有水的情況下轉酯化效率很低，基本沒有脂肪酸乙酯的生成。當水含量增加到5%時，轉酯化效率達到最高，此時脂肪酸乙酯得率為44%。繼續(xù)提高水含量，轉酯化效率隨之降低，這可能是由于過多的水存在時，脂肪酶水解活性增強，水解生成的脂肪酸乙酯，導致產率下降。

圖11 水含量對轉酯化反應的影響Fig.11 Influence of water content on transesterification

2.5.2 醇油摩爾比對轉酯化反應的影響 醇油摩爾比是影響轉酯化反應的另一個重要因素。理論上，1 moL油脂需要3 moL乙醇來醇解，但往往總是需要更多的乙醇來保證反應的充分進行。如圖12，在醇油摩爾比為3∶1時，脂肪酸乙酯得率為40%；當醇油摩爾比增加到增加到4∶1時，脂肪酸乙酯得率達到最高44%；繼續(xù)增加醇油摩爾比，脂肪酸乙酯得率有所下降，在醇油摩爾比為6∶1時，脂肪酸乙酯得率最高僅為21%，此時乙醇體積分數遠大于4%，過多的乙醇能抑制了脂肪酶酶活，導致轉化率有所下降。

圖12 醇油摩爾比對轉酯化反應的影響Fig.12 Influence of ethanol/oil molar ratio on transesterification

2.5.3 酶添加量對轉酯化反應的影響 在轉酯化反應過程中控制脂肪酶添加量能夠降低生物柴油的生產成本。如圖13，在醇油摩爾比為4∶1時，5%的酶添加量可以得到脂肪酸乙酯的得率為44%，當酶量增加到10%時，脂肪酸乙酯得率最高僅為49%。繼續(xù)增加酶量到20%時，脂肪酸乙酯得率有所下降，這可能是由于過量酶粉降低了反應體系的流動性，導致轉化效率有所降低。

圖13 酶添加量對轉酯化反應的影響Fig.13 Influence of lipase amount on transesterification

3 結 論

本文嘗試建立一種低碳綠色的利用餐廚廢棄油脂制備生物柴油的新工藝。畢赤酵母中對米根霉脂肪酶實現了高效的分泌表達，重組脂肪酶酶活高達(426.6±0.8) U/mL，相比已報道的在大腸桿菌和釀酒酵母中表達的重組脂肪酶酶活有很大的優(yōu)勢[22]，進一步降低了脂肪酶和后續(xù)轉酯化反應的成本，具有了工業(yè)化應用的潛力。其次，我們在采用環(huán)境友好的酶法制備生物柴油的同時，還選擇了毒性較低的乙醇替代甲醇作為?；荏w來制備生物柴油，并詳細研究了水含量、醇油摩爾比、酶添加量對轉酯化反應的影響，整體上實現了對餐廚廢棄油脂的綠色轉化，為進一步的工業(yè)化應用提供了一定的依據。

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Rhizopusoryzaelipase preparation and its application in the conversion of waste cooking oil

JIANGSujun,LINJianghai,LVXiaojing,XIAOWenjuan,GONGYingxue,LIUZehuan

(College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632,China)

Using lipase to change waste cooking oil into biodiesel can achieve the goal of green, recycling of food waste. A gene encodingRhizopusoryzaelipase containing prosequence(ProROL) was cloned into the pGAPZαA and electrotransformed into thePichiapastorisX-33 strain. The lipase was functionally expressed and secreted with a molecular weight of 35 000. The lipase activity was (426.6±0.8) U/mL when using olive oil as substract. Using waste cooking oil as the raw material and alcohol as acyl receptor, lipase as catalyst for the production of fatty acid ethyl ester, 49% of the fatty acid ethyl ester yield was obtained when the water content is 5%, the alcohol oil molar ratio is 4∶1, and lipase adding amount is 10%, under this condition the fatty acid ethyl ester yield is 49%.

food waste; biodiesel;Rhizopusoryzae; lipase;Pichiapastoris

10.13471/j.cnki.acta.snus.2016.02.020

2015-04-07

姜蘇峻(1990年生)，男；研究方向：秸稈降解微生物的基因組和代謝工程；通訊作者：劉澤寰;E-mail:zhliu@jnu.edu.cn

Q815

A

0529-6579(2016)02-0111-06