李　偉，馬朋朋，周　超

(1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院骨科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院，河北 張家口 075000)

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早期創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死兔模型早期治療分子機制探討

李偉1，馬朋朋1，周超2

(1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院骨科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院，河北 張家口 075000)

摘要：目的探討早期創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死的分子機制。方法建立早期創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死兔模型，應(yīng)用免疫組化方法觀察股骨頭缺血性壞死發(fā)生發(fā)展過程。結(jié)果股骨頭缺血性壞死早期血管生成抑制，股骨頭內(nèi)重要組織損傷伴細胞凋亡，同時可見Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原介導的纖維化修復和血管性血友病因子誘生的新生血管。結(jié)論早期創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死存在短期的自我恢復，這可能為早期創(chuàng)傷性股骨頭缺血性壞死提供一個最佳治療時機。

關(guān)鍵詞：股骨頭缺血性壞死；早期創(chuàng)傷；兔模型；骨組織修復；血管再生；細胞凋亡；分子機制

股骨頭缺血性壞死(avascular necrosis of the femoral head,ANFH)是由于各種原因?qū)е鹿晒穷^血運循環(huán)障礙造成的股骨頭發(fā)生缺血性骨壞死的病理性變化過程。ANFH多見于20～50歲青壯年，并多數(shù)累及雙側(cè)股骨頭，致殘率極高。ANFH的發(fā)生與創(chuàng)傷、酗酒、激素等多種因素有關(guān)，發(fā)病機制尚未完全闡明[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白是現(xiàn)有存在于骨和皮膚細胞外基質(zhì)中最豐富的蛋白質(zhì)，可通過粗大的纖維維持組織穩(wěn)定性及參與組織修復；Ⅲ型膠原亦參與組織修復過程[4]，其出現(xiàn)時間甚至早于Ⅰ型膠原；血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)是內(nèi)皮細胞的標志，可反映血管系統(tǒng)的狀況[5]；同時，血運循環(huán)障礙導致了細胞凋亡這一不可避免的結(jié)果，其調(diào)控涉及到信號分子與轉(zhuǎn)錄因子，如p-JNK、p53等的相互作用。這些分子在ANFH中的相互關(guān)系和作用尚不清楚，深入研究這些分子的作用機制助于理解受損骨組織發(fā)生的改變，為早期創(chuàng)傷性ANFH持續(xù)有效的治療提供積極參考。

1材料和方法

1.1動物

45只健康成年雄性新西蘭兔，平均體質(zhì)量3 kg，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)。隨機分為5組，對照組5只，對照組不做任何處理，其余40只單方面接受手術(shù)，在指定時間處死，術(shù)后行影像學、病理學檢查(表1)。所有動物均按照美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護理和使用指南》的規(guī)定進行護理。

表1　動物分組(n)

1.2手術(shù)方法

所有接受手術(shù)的動物按30 mg·kg-1體質(zhì)量靜脈注射體積分數(shù)為30%的戊巴比妥鈉進行麻醉。無菌條件下后外側(cè)切口到達左髖關(guān)節(jié)，在關(guān)節(jié)囊處切3 cm切口暴露股骨頭。從切口分離包括環(huán)狀韌帶在內(nèi)的所有軟組織附件，從股骨頸基底部截斷，縫合髖關(guān)節(jié)囊邊緣以確保分離的股骨頭不脫離關(guān)節(jié)窩。手術(shù)傷口用青霉素充分沖洗，然后逐層縫合。所有動物均肌內(nèi)注射200 000 U青霉素以防感染。術(shù)后，所有動物可在籠中自由活動。

1.3影像學檢查

動物麻醉后，進行CT和MRI掃描，監(jiān)測國際骨循環(huán)研究會(the association research circulation osseuse,ARCO)制定的ANFH臨床分期，ARCO I～II期為早期ANFH，MRI表現(xiàn)缺血區(qū)的骨髓水腫，股骨頭“雙線征”[6]。

1.4病理組織學觀察

動物以空氣注射法處死，剖取雙側(cè)股骨頭連同干骺端及股骨，肉眼觀察后，取材，置于4%多聚甲醛溶液固定3 d；10% EDTA-PBS緩沖液脫鈣，每3天更換脫鈣液一次，觀察骨標本表面顏色并用物理法測定其脫鈣程度，直到滿意為止。取材逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，然后行蘇木素-伊紅(hematoxylineosin,HE)染色，光鏡觀察骨膜、軟骨組織、骨小梁、造血組織的變化。隨機選定10張HE染色切片，在100倍視野下計數(shù)空骨陷窩和骨髓造血細胞。采用鏈霉親和生物素試劑盒進行免疫組化檢測，Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、p53、vWF和p-JNK的一抗37 ℃孵育1 h，山羊抗鼠IgG二抗孵育30 min，DAB顯色。每張切片隨機選取10個視野，在200倍視野下測量陽性著色區(qū)的積分光密度(IOD)。Image-Pro Plus 6.0軟件對圖像進行半定量分析，染色陽性率表示為單位面積骨髓或骨小梁中的IOD。

1.5統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1HE染色

正常股骨頭骨膜光滑，軟骨細胞排列整齊；骨小梁中的骨細胞豐富、清晰可見，柱狀成骨細胞沿骨小梁成群分布；骨髓造血細胞豐富。手術(shù)后，骨膜逐漸不完整，軟骨部分脫落；骨小梁稀疏、變細，結(jié)構(gòu)紊亂；空骨陷窩增加，骨細胞核固縮；仍然可見梭形成骨細胞排列，但數(shù)量漸減；造血功能隨時間推移逐漸減弱；血管內(nèi)皮細胞聚集，血管栓塞出現(xiàn)；部分脂肪細胞失去原有圓形，與鄰近脂肪細胞融合；在本次研究結(jié)束時，大多數(shù)組織細胞死亡并失去正常形態(tài)。從手術(shù)后d 3開始，股骨頭外部有大量間葉細胞浸潤，在第2周達到高峰，之后大量細胞死亡；骨小梁間隙中的骨髓成分減少，空骨陷窩顯著增加(P<0.05)(圖1)。

2.2細胞凋亡調(diào)控

p53和p-JNK相互作用、功能上相互補充，協(xié)同調(diào)節(jié)細胞凋亡。正常組織中p53只在某些造血細胞中高表達，成骨細胞和骨細胞不表達。手術(shù)后，成骨細胞和大部分造血細胞表達中等水平p53；血管內(nèi)皮細胞和破骨細胞高表達p53，并且延續(xù)到實驗結(jié)束。p-JNK在正常造血組織中以不同水平廣泛表達，但成骨細胞不表達。手術(shù)后表達p-JNK的細胞數(shù)量增加，包括破骨細胞、部分成骨細胞和骨細胞，且在前3周血管內(nèi)皮細胞的表達水平便逐漸升高(圖2)。

圖1　兔創(chuàng)傷性ANFH病理組織學圖像和半定量分析

AHE染色，刻度標尺=50 μm；B左邊：條形圖表示骨髓細胞與骨髓面積的比例；右邊：條形圖表示空骨陷窩與骨小梁面積的比例；CHE染色顯示受損股骨頭周圍MSCs細胞浸潤，刻度標尺=100 μm。N：正常組；3 d：建模后3 d；1周：建模后1周；2周：建模后2周；3周：建模后3周。每張切片至少觀察10個視野，與正常組比較﹡P<0.05

圖2　p-JNK和p53免疫組化染色及半定量分析，刻度標尺=50 μm

Ap-JNK免疫組化染色；B條形圖表示單位面積骨髓中p-JNK的表達密度；Cp53免疫組化染色；D條形圖表示單位面積骨髓中p53的表達密度，N：正常組；3 d：建模后3 d；1周：建模后1周；2周：建模后2周；3周：建模后3周。每張切片至少觀察10個視野，與正常組比較﹡P<0.05

2.3骨組織損傷和血管供應(yīng)

骨小梁和骨髓均表達Ⅰ型膠原蛋白，骨髓腔周圍骨小梁的表達比中央略強，提示活化的成骨細胞位置。手術(shù)后骨小梁Ⅰ型膠原蛋白的表達水平持續(xù)升高，且最終顯著高于對照組(P<0.05)。從創(chuàng)傷后第2周起表達Ⅰ型膠原蛋白的骨細胞數(shù)量明顯增加，但是在第3周表達水平顯著降低。相比之下，Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白和vWF在骨髓中的表達均在創(chuàng)傷后d 3開始增加，然后持續(xù)下降。值得注意的是，骨髓中Ⅰ型膠原蛋白和vWF的表達水平僅在d 3顯著高于正常組(P<0.05)，此時這兩種蛋白細胞分布最廣泛。到第3周結(jié)束時，vWF明顯低于正常組(P<0.05)，說明血管阻塞。盡管從d 3開始受損組織Ⅲ型膠原蛋白的表達水平下降，但其表達量自始至終都顯著高于正常組織(P<0.05)，這在破骨細胞和血管內(nèi)皮細胞尤為顯著(圖3)。

圖3　I型膠原、III型膠原和vWF免疫組化染色及半定量分析，刻度標尺=50 μm

AI型膠原免疫組化染色；B左邊：條形圖表示單位面積骨髓中I型膠原的表達密度；右邊：條形圖表示單位面積骨小梁中I型膠原的表達密度；CIII型膠原免疫組化染色；D條形圖表示單位面積骨髓中III型膠原的表達密度；EvWF免疫組化染色；F條形圖表示單位面積骨髓中vWF的表達密度。N：正常組；3 d：建模后3 d；1周：建模后1周；2周：建模后2周；3周：建模后3周。每張切片至少觀察10個視野。與正常組比較﹡P<0.05

3討論

ANFH是一不可逆過程，早期診斷和早期治療非常關(guān)鍵，建立與臨床病程相似的早期ANFH動物模型，對探究ANFH進展的分子機制，進而尋求新的有效的治療方法具有十分重要的意義。

根據(jù)HE染色病理分析結(jié)果，組織細胞走向凋亡，與p-JNK、p53表達增加一致。JNK的活化依賴于細胞生存壓力，在許多情況下，包括凋亡發(fā)生的過程中均參與p53的活化[7]。作為腫瘤抑制基因，p53介導一系列細胞反應(yīng)，包括抑制受損細胞生長和細胞內(nèi)壓力引起的細胞凋亡。結(jié)果顯示，造血和骨組織中大量細胞死亡，導致本研究檢測的大部分分子最終減少。

本研究發(fā)現(xiàn)d 3骨髓中Ⅰ型膠原蛋白出現(xiàn)峰值水平，這與之前所報道的全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后第3周患者血清中的趨勢相一致，表明在清除創(chuàng)傷產(chǎn)生的組織碎片的過程中破骨細胞活性升高，并且與1年后患者的骨密度降低密切相關(guān)(r=-0.42,P=0.003)[8]。在兩項研究中峰值水平出現(xiàn)的具體時間的差異可能是由于檢測位置的不同。此外，受損軟骨中Ⅰ型膠原蛋白的表達提示軟骨退化時組織纖維化修復。在這項研究中，我們沒有發(fā)現(xiàn)軟骨中有Ⅰ型膠原表達，表明疾病處于早期，軟骨尚未退化。在組織修復的早期階段，Ⅲ型膠原常高度表達，比Ⅰ型膠原更快地形成聚合物以填充受損組織，促進組織修復。在本研究中，受損組織Ⅲ型膠原的表達水平自始至終都顯著高于正常組織，表明細胞和組織構(gòu)成的狀況發(fā)生改變。vWF是在人血管內(nèi)皮細胞、巨核細胞、血小板中發(fā)現(xiàn)的血漿糖蛋白，主要存在于內(nèi)皮細胞的Weibel-Palade小體中，是內(nèi)皮細胞的特有標志[9]。創(chuàng)傷后d 3這3個分子均出現(xiàn)高峰，提示出現(xiàn)一個快速的組織修復，與爬行替代一致，涉及環(huán)繞死骨進行血管重建和骨組織修復。但是，vWF表達水平的急劇降低表明血管阻塞，加上細胞活力降低，損傷狀況不能逆轉(zhuǎn)，疾病終將會發(fā)展到軟骨塌陷的程度。

在本研究中，我們建立了早期創(chuàng)傷性ANFH兔模型。HE染色和p53、p-JNK表達顯示ANFH從創(chuàng)傷后d 3開始發(fā)生，同時Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和vWF的高度表達提示創(chuàng)傷后早期股骨頭存在自我修復，合理利用這一關(guān)鍵時機將提高早期治療ANFH的療效。

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[責任編輯：李薊龍英文編輯：劉彥哲]

Molecular Mechanism in Early Treatment of Early Stage Traumatic Avascular Necrosis of Femoral Head in a Rabbit Model

LI Wei1,MA Peng-peng1,ZHOU Chao2

(1.Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital，Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China;2.Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the molecular mechanism of the early stage traumatic avascular necrosis of femoral head.MethodsWe established a rabbit early stage traumatic avascular necrosis of femoral head model.The process of avascular necrosis of femoral head was observed by immunohistochemical staining.ResultsIn early stage traumatic avascular necrosis of femoral head,the suppression of angiogenesis,significant tissue damage within the femoral head and accompanied cell apoptosis were observed in osteonecrosis of femoral head.We also observed the repairative fibrosis mediated by type I collagen and type III collagen and neovascularization induced by von Willebrand factor.ConclusionSuch a short-term restoration may provide an optimal timing for therapy of early stage traumatic osteonecrosis of femoral head in clinic application.

Key words:avascular necrosis of femoral head;early stage traumatic model;rabbit model;bone tissue repair;angiogenesis;apoptosis;molecular mechanism

DOI：10.3969/j.issn.1673-1492.2016.04.004

中圖分類號：R 641

文獻標識碼：A

作者簡介：李偉(1977-)，男，北京昌平人，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向：創(chuàng)傷骨科。

來稿日期：20160314