邱偉文，鄭麗云，鄔至平，蔡學(xué)禮，彭瀟，黃躍金，黃良通（麗水市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

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腦心通對(duì)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和自噬的影響

邱偉文，鄭麗云，鄔至平，蔡學(xué)禮，彭瀟，黃躍金，黃良通
（麗水市中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 麗水 323000）

［摘 要］目的：觀察腦心通對(duì)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖和自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3表達(dá)的影響，探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化（AS）的可能機(jī)制。方法：將人臍動(dòng)脈VSMC分為：對(duì)照組、ox-LDL組、腦心通組、ox-LDL+腦心通組。采用噻唑藍(lán)（MTT）法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖作用，Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Beclin1與LC3表達(dá)水平的改變。結(jié)果：ox-LDL顯著促進(jìn)VSMC的增殖和克隆形成，而腦心通對(duì)VSMC的增殖和克隆形成無明顯作用，但其抑制ox-LDL對(duì)VSMC增殖和克隆形成的促進(jìn)作用。Western blot結(jié)果顯示ox-LDL顯著增加VSMC自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)水平；腦心通抑制ox-LDL增加的Beclin1和LC3的表達(dá)。MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)自噬抑制劑3MA抑制ox-LDL對(duì)VSMC的增殖作用。結(jié)論：腦心通可能通過降低VSMC自噬抑制ox-LDL對(duì)VSMC的增殖作用。

［關(guān)鍵詞］腦心通；氧化低密度脂蛋白；細(xì)胞自噬；血管平滑肌細(xì)胞

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)。AS的發(fā)病機(jī)制存在多種學(xué)說，涉及多種危險(xiǎn)因素，臨床尚缺乏有效的防治藥物。腦心通是一種中成藥，已廣泛應(yīng)用于治療心腦血管疾病，具有抗AS、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、穩(wěn)定AS易損斑塊、保護(hù)缺血再灌注損傷神經(jīng)及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用［1］。婁莉等［2］研究表明腦心通能明顯抑制氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖作用，然而腦心通的作用機(jī)制仍未明確。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的細(xì)胞生物學(xué)行為，是一種進(jìn)化上高度保守的、用于降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)生物大分子和受損細(xì)胞器的過程，是細(xì)胞進(jìn)行自我保護(hù)的一種重要機(jī)制，在維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用，并參與細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等過程［3］。本研究通過噻唑藍(lán)（MTT）法、克隆形成和Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞自噬在腦心通抑制ox-LDL誘導(dǎo)VSMC增殖中的作用，探討腦心通抗AS的可能機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料 人臍動(dòng)脈VSMC購(gòu)買于上海生命科學(xué)細(xì)胞庫(kù)；腦心通由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025001；ox-LDL購(gòu)買于北京協(xié)和生物科技有限公司；鼠源性抗體Tubulin購(gòu)買于Sigma公司；Beclin1、LC3單克隆抗體購(gòu)買于CST公司；MTT、3MA購(gòu)買于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1人臍動(dòng)脈VSMC培養(yǎng)：使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清MEM培養(yǎng)液，在細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)接種細(xì)胞后置入37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期、增殖旺盛細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將增殖的VSMC分為對(duì)照組、ox-LDL組、腦心通組、ox-LDL+腦心通組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMC，調(diào)細(xì)胞密度為2×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL。細(xì)胞貼壁之后，棄去培養(yǎng)液，然后加入不同處理?xiàng)l件培養(yǎng)基，對(duì)照組不加藥，并設(shè)置調(diào)零孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃恒溫箱孵育4 h后，棄去上清液，加入DMSO 120 μL終止反應(yīng)。 以調(diào)零孔光密度值（OD）調(diào)零校準(zhǔn)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在492 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔的OD值。

1.2.3細(xì)胞克隆形成：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，臺(tái)盼藍(lán)作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，將調(diào)整后的細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔500個(gè)細(xì)胞。置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)10 d，每隔3 d更換一次培養(yǎng)基。棄生長(zhǎng)液，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色液染色30 min。顯微鏡下計(jì)細(xì)胞集落數(shù)（集落標(biāo)準(zhǔn)：含有50個(gè)以上細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為一個(gè)細(xì)胞集落）并照相。

1.2.4Western blot法檢測(cè)信號(hào)通路改變：不同條件處理VSMC后，預(yù)冷PBS漂洗2次，隨后加入細(xì)胞裂解液冰上裂解15 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清。BAC法進(jìn)行蛋白定量，取20 μg總蛋白4%～12%聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，3%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃孵育過夜，隨后PBST緩沖液洗膜3次，每次8 min，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1～2 h，PBST緩沖液再次洗膜3次，每次8 min，ECL試劑發(fā)光、顯影和定影，ImageJ軟件分析，以Tubulin為內(nèi)參，目標(biāo)條帶與內(nèi)參灰度值的比值反映相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，各觀察值間的多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較采用最小顯著性差異t（LSD-t）檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腦心通抑制ox-LDL的促進(jìn)VSMC增殖的作用

ox-LDL組中，0～60 mg/L ox-LDL呈劑量依賴性促進(jìn)VSMC增殖，OD值分別為：0.77±0.05（0 mg/L）、0.97±0.01（20 mg/L）、1.09±0.05（40 mg/L）、1.31±0.11（60 mg/L）；腦心通組中，0.2～0.8 g/L腦心通對(duì)VSMC的活性無明顯抑制作用，腦心通（0～0.8 g/L）呈劑量依賴性抑制ox-LDL（40 mg/L）對(duì)VSMC增殖的促進(jìn)作用，OD值分別為：0.85±0.11（0 g/L）、1.14±0.09（0.2 g/L）、1.06±0.07（0.4 g/L）、0.75±0.08（0.8 g/L），見圖1。各組細(xì)胞克隆形成率分別為：100%（對(duì)照組）、185.5%±3.1%（40 mg/L ox-LDL組）、102.4%±2.6%（0.8 g/L腦心通組）、105.4%±1.6%（40 mg/L ox-LDL+0.8 g/L腦心通組），與對(duì)照組相比，40 mg/L的ox-LDL克隆形成明顯增高（P＜0.01），0.8 g/L腦心通對(duì)VSMC的克隆形成無明顯作用，但與40 mg/L ox-LDL相比，0.8 g/L腦心通抑制ox-LDL促進(jìn)VSMC的克隆形成（P＜0.05），見圖2。

2.2腦心通抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC自噬激活作用

Beclin1和LC3表達(dá)是細(xì)胞發(fā)生自噬的關(guān)鍵蛋白，反映細(xì)胞自噬強(qiáng)度。Western blot結(jié)果顯示，ox-LDL組與對(duì)照組比，不同劑量ox-LDL呈劑量依賴性增加VSMC自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)，而ox-LDL+腦心通組中，腦心通能夠明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達(dá)，見圖3。

2.3自噬抑制劑3MA抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖

為進(jìn)一步證明自噬的作用設(shè)立自噬抑制劑ox-LDL+ 3MA組，MTT法結(jié)果顯示，對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL+ 3MA組的OD值分別為：0.95±0.11、1.32±0.10［與對(duì)照組比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）］、0.85± 0.6［與對(duì)照組比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）］，3MA抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖，見圖4。

3　討論

圖1　腦心通抑制ox-LDL的促VSMC增殖作用

ox-LDL是AS的重要危險(xiǎn)因子，誘發(fā)血管內(nèi)皮損傷，參與AS的發(fā)生與發(fā)展。腦心通是一種用于治療各種心腦血管疾病的中成藥，其治療效果已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同。研究表明腦心通明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖作用，但其內(nèi)在機(jī)制仍未完全明確。本研究探討腦心通調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬抑制ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖作用。

圖2 各組細(xì)胞克隆形成圖

AS是血管壁內(nèi)皮細(xì)胞、脂質(zhì)、單核巨噬細(xì)胞、VSMC及血小板相互作用而導(dǎo)致的慢性炎性反應(yīng)，是眾多心腦血管疾病共同的病理基礎(chǔ)，嚴(yán)重危害人類健康［4］。自噬是維持細(xì)胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要活動(dòng)過程［5］。自噬功能紊亂參與多種疾病的發(fā)生。目前自噬參與AS形成的觀點(diǎn)已得到廣泛認(rèn)同。有研究［6］表明自噬在AS形成過程起重要保護(hù)作用，而且泡沫細(xì)胞自噬功能混亂導(dǎo)致血管炎癥發(fā)生，加速AS形成［7］。盡管自噬如何影響AS形成尚未完全明確，但多種調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬功能的藥物已應(yīng)用于預(yù)防和治療AS，如雷帕霉素、依維莫司、丹酚酸B、黃芩、射干苷等［8］。

腦心通作為一種中成藥物，由黃芪、水蛭、地龍、全蝎、當(dāng)歸、川芎、丹參、紅花、赤芍、桂枝、牛膝等16種中藥制成，具有益氣活血、健脾化痰、化瘀通絡(luò)等功效，有抗AS、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、穩(wěn)定AS易損斑塊作用和保護(hù)缺血再灌注損傷神經(jīng)及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用［9］。席東焱［10］研究表明腦心通具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和改善血小板功能的作用；劉振權(quán)等［11］研究發(fā)現(xiàn)腦心通對(duì)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞模擬腦缺血損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)。目前腦心通對(duì)VSMC作用的研究較少，婁莉等［2］研究發(fā)現(xiàn)腦心通能明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)VSMC增殖作用。本研究結(jié)果顯示有效劑量的腦心通對(duì)VSMC無明顯毒性作用。ox-LDL明顯促進(jìn)VSMC的增殖，腦心通抑制ox-LDL促進(jìn)VSMC增殖作用，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)告一致。

在細(xì)胞因子、炎性反應(yīng)、趨化因子、生長(zhǎng)因子及致病因素等作用下，VSMC發(fā)生細(xì)胞增殖和功能轉(zhuǎn)變［12］。ox-LDL是AS的重要危險(xiǎn)因子，能夠促進(jìn)VSMC增殖和功能轉(zhuǎn)變［13］。Li等［14］研究發(fā)現(xiàn)c-Ski抑制ox-LDL和血小板源性生長(zhǎng)因子對(duì)VSMC自噬和增殖的促進(jìn)作用。Ding等［15］研究發(fā)現(xiàn)低濃度（10～40 μg/mL）ox-LDL促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin1與Atg5的表達(dá)和細(xì)胞增殖，而高濃度（60 μg/ mL）ox-LDL抑制自噬，促進(jìn)VSMC凋亡。Grootaert等［16］研究發(fā)現(xiàn)Atg7敲除誘發(fā)的細(xì)胞自噬缺陷加速VSMC死亡，促進(jìn)內(nèi)膜和粥樣斑塊形成。因此，ox-LDL促進(jìn)VSMC增殖可能與其促進(jìn)細(xì)胞自噬激活有關(guān)。和LC3的表達(dá)增高，同時(shí)降低了ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖，這一作用與自噬抑制劑3MA對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖相同。

圖3 ox-LDL和腦心通對(duì)Beclin1和LC3表達(dá)的影響

圖4　MTT法檢測(cè)VSMC增殖結(jié)果

綜上所述，腦心通降低VSMC自噬活性，抑制ox-LDL促進(jìn)VSMC增殖和細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3表達(dá)，這一過程可能參與腦心通抗AS的作用。

參考文獻(xiàn)：

Beclin-1是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，與III型磷脂酰肌醇-3激酶形成復(fù)合物參與自噬體形成，是自噬形成和成熟的標(biāo)志。LC3位于前自噬泡和自噬泡膜表面，參與自噬形成，存在I型和II型2種分子。發(fā)生自噬時(shí)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的LC3I型與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3II型，是自噬體的標(biāo)示，用LC3II/LC3I比值表示細(xì)胞自噬強(qiáng)度。本研究結(jié)果顯示ox-LDL增高了VSMC中LC3和Beclin1的表達(dá)；而腦心通抑制ox-LDL誘導(dǎo)VSMC的Beclin1

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

The effects of naoxintong on vascular smooth muscle cells proliferation and autophagy induced by oxidized low-density lipoprotein

QIU Weiwen，ZHENG Liyun，WU Zhiping，CAI Xueli，PENG Xiao，HUANG Yuejin，HUANG Liangtong. Department of Neurology，Lishui Central Hospital，Lishui，323000

Abstract:Objective: To investigate the effects of naoxintong on the vascular smooth muscle cells （VSMC） proliferation and the expression of Beclin1 and LC3 induced by oxidized low-density lipoprotein （ox-LDL）. Methods: The VSMC were divided into four groups: control group，ox-LDL group，naoxintong group and ox-LDL+naoxintong group. MTT and colony formation assay was used to test the proliferation. Western blot was used to analysis the expression of Beclin1 and LC3. Results: ox-LDL significantly promoted the viability and colony formation of VSMC. Naoxintong had no effect on the proliferation and colony formation but inhibited the proliferation and colony formation of VSMC induced by ox-LDL. Western blot results demonstrated that ox-LDL significantly promoted the expression of Becli1 and LC3，naoxintong inhibited the expression of Beclin1 and LC3 induced by ox-LDL. Furthermore，MTT verified that autophagy inhibitors 3MA inhibited significantly the proliferation induced by ox-LDL. Conclusion: Naoxintong inhibited the VSMC proliferation induced by ox-LDL through inhibited the cell autophagy.

Key words:naoxintong； ox-LDL； autophagy； vascular smooth muscle cells

作者簡(jiǎn)介：邱偉文（1966-），男，浙江麗水人，副主任醫(yī)師，碩士。

基金項(xiàng)目：浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（2015KYB451）。

收稿日期：2016-01-07

［中圖分類號(hào)］R285；R743.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.006