謝海青，張俊麗，謝翔，金勝威（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

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Maresin 1通過調控miR-340增強巨噬細胞吞噬功能

謝海青，張俊麗，謝翔，金勝威
（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325027）

［摘 要］目的：研究促消退介質Maresin 1（MaR1）在膿毒癥模型中促進巨噬細胞吞噬功能的機制。方法：通過檢測F4/80表達情況評估小鼠原代巨噬細胞純度。體內外膿毒癥模型驗證脂多糖（LPS）和/或MaR1對miR-340表達的影響。骨髓巨噬細胞轉染miR-340模擬物（mimic）或抑制劑（inhibitor）后，qRT-PCR檢測miR-340的表達量，評估轉染效率。熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測小鼠原代巨噬細胞轉染miR-340 mimic后巨噬細胞吞噬熒光微球能力的變化。最后收集臨床樣本檢測膿毒癥患者血漿中miR-340的表達與健康志愿者的區(qū)別。結果：經熒光顯微鏡和流式細胞儀鑒定小鼠原代巨噬細胞純度達90%以上。體內外膿毒癥模型均顯示miR-340的表達明顯升高（P＜0.05）。膿毒癥患者與健康志愿者相比血液中miR-340的表達也顯著增強（P＜0.05）。熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測小鼠原代巨噬細胞轉染miR-340 mimic后，巨噬細胞吞噬熒光微球的能力降低（P＜0.05）。在體內外膿毒癥模型中，MaR1均明顯降低miR-340的表達水平（P＜0.05）。結論：MaR1通過抑制miR-340的表達，增強巨噬細胞吞噬功能，在膿毒癥病理生理過程中發(fā)揮抗炎促消退作用。

［關鍵詞］Maresin 1；脂多糖；miR-340；膿毒癥；巨噬細胞；吞噬作用；小鼠

膿毒癥是感染引起的有害的復雜臨床綜合征［1］，以系統(tǒng)性炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和菌血癥為特征，嚴重者可發(fā)展至多器官衰竭，甚至死亡［2］。臨床治療膿毒癥的方法主要為抗炎，常使用高劑量糖皮質激素［3］、白介素-1受體拮抗劑［4］、Toll樣受體拮抗劑［5］等。然而這些方法并不能降低膿毒癥的病死率。近年越來越多的研究者認為膿毒癥后期處于免疫抑制狀態(tài)，并提出促炎癥消退新策略—提高自身免疫，促進炎癥消退。證據顯示炎癥消退是一個主動的調節(jié)過程，依賴機體產生一系列的內源性抗炎促消退介質（specialized pro-resolving mediators，SPMs），及時減少和限制組織過度損傷，促進炎癥消退，恢復機體內穩(wěn)態(tài)［6］。Maresin 1（MaR1）系最近發(fā)現的促炎癥消退新介質［7］，能減輕酵母多糖誘導的腹膜炎［7］，抑制中性粒細胞浸潤，增強巨噬細胞吞噬能力，具有強大的抗炎促消退作用［8］。本研究主要探討MaR1促進巨噬細胞吞噬功能的具體機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物 SPF級健康C57BL/6J雄性小鼠，體質量18～25 g，來自上海SLAC實驗動物公司（動物合格證號：XI304239，已通過動物實驗倫理學批準），飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心。所有進入實驗室的人、動物均需經嚴格的微生物控制，所有飼料、水、鋪墊物等所需物均經高溫滅菌處理。

1.2實驗試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司；巰基乙酸肉湯、臺盼藍、EDTA· 2Na、大腸桿菌脂多糖（LPS，055：B5）、熒光微球（L3030）購自Sigma公司；MaR1購自Cayman公司；巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）由R&D公司提供；所有micro-RNA相關試劑均來自廣州市銳博生物科技有限公司；APC anti-Mouse F4/80抗體、Cell stain buffer購自BioLegend公司。

1.3小鼠腹腔巨噬細胞分離 提前5 d向小鼠腹腔注入3%巰基乙酸肉湯，當天脫頸處死小鼠，暴露腹膜，向腹腔內注入5 mL 3% FBS-PBS，充分按摩小鼠腹部，抽取腹腔液，離心棄上清液，加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)基重懸；用0.4%臺盼藍染色，當活細胞數達到95%以上時調整細胞濃度2×106cells/mL，接板，置于5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；1 h后，棄培養(yǎng)基，去除未貼壁的細胞，加入10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)基，置于細胞培養(yǎng)箱，次日用于實驗。

1.4小鼠骨髓巨噬細胞培養(yǎng) 實驗當天脫頸處死小鼠，暴露后肢皮膚，分離出完整的股骨和脛骨，移至超凈臺；用剪刀剪斷股骨和脛骨的兩端，用PBS進行骨髓腔灌洗，收集灌洗液；離心棄上清液，加入紅細胞裂解液，靜置5 min；離心棄上清液，用含有M-CSF（濃度為20 ng/mL）的10% FBS-DMEM完全培養(yǎng)基重懸，計數調整為4×106cells/mL，接75 cm2培養(yǎng)瓶，置于細胞培養(yǎng)箱中；第3天更換含有M-CSF的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；第5天棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入提前預熱的5 mmol/L EDTA-PBS消化10 min，再用細胞刮刀消化細胞并收集；4 ℃離心棄上清液，加入完全培養(yǎng)基重懸；0.4%臺盼藍染色計數接板，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日用于實驗。

1.5小鼠盲腸結扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）模型的建立及樣本收集

1.5.1中度CLP模型建立：腹腔注射戊巴比妥鈉（80 mg/kg）并監(jiān)測麻醉深度；對腹部皮膚進行備皮及消毒；沿腹中線作正中切口，暴露腹白線并剪開腹膜，找到盲腸置于小鼠腹部左側；在盲腸基底部和游離端中間處結扎；將盲腸內容物向遠端輕輕擠壓，于結扎處和游離端中間用21 G穿刺針從腸系膜側刺向游離側；拔出穿刺針后，擠壓盲腸，見腸內容物從腸系膜側孔和游離側孔處擠出；將盲腸放回腹腔內，連續(xù)縫合腹膜，間斷縫合皮膚；皮下注射氯化鈉注射液（50 mL/kg）進行補液，在保溫毯內進行復蘇，每6 h觀察動物的情況和存活率，24 h收集樣本。

1.5.2實驗分組：①假手術（Sham）組：暴露盲腸后，不結扎不穿刺，將其放回，縫合腹膜及皮膚。②中度膿毒癥（CLP）組：參照1.5.1步驟建立CLP模型。③中度膿毒癥治療（CLP+MaR1）組：CLP模型造好后15 min，腹腔注射MaR1（每只小鼠注射100 ng MaR1）。

1.5.3收集樣本：24 h后存活的小鼠用戊巴比妥鈉（80 mg/kg）進行麻醉，腹腔注射肝素（100 U/100 g），固定在操作臺上，剪開頸部皮膚，分離肌肉和筋膜，暴露頸動脈，剪破頸動脈，并用注射器收集血液于離心管中。4 ℃離心5 min，吸取上清液，即血漿，-80 ℃保存待用。

1.6臨床樣本的選擇及處理

1.6.1研究對象入選標準：選取2015年3月至9月于溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院重癥監(jiān)護室、溫州中西醫(yī)結合醫(yī)院重癥監(jiān)護室、瑞安市人民醫(yī)院重癥監(jiān)護室住院治療的膿毒癥患者8例為膿毒癥組，年齡25～75歲，均符合美國重癥醫(yī)學會（SCCM）聯(lián)合歐洲危重病醫(yī)學會（ESICM）2012年提出的膿毒癥診斷標準。選取同期門診健康體檢者5例為健康志愿組，年齡25～75歲，2周內未服用任何藥物。

本研究符合赫爾辛基宣言并通過溫州醫(yī)科大學倫理委員會審批，同時所有患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

1.6.2排除標準：不符合入選標準；懷孕或哺乳期婦女；長期使用抗凝藥物者；長期服用免疫抑制藥物或長期處于免疫抑制狀態(tài)，如HIV陽性患者；嚴重心律失?；颊?。

1.6.3剔除標準：納入后不符合診斷標準者；有其他干擾因素影響數據真實性者。

1.6.4樣本收集及處理：膿毒癥患者入選后在達到診斷標準24 h內，應用抗生素前，取2 mL新鮮外周血于去酶抗凝管中，4 ℃離心5 min，吸取上清液，即血漿，-80 ℃保存待用。

1.7細胞轉染技術 按照riboFECTTMCP轉染試劑使用說明對腹腔巨噬細胞和骨髓巨噬細胞進行轉染，采用定量PCR方法檢測轉染效率，選擇最佳轉染劑量和時間。

1.8細胞免疫熒光技術 取出細胞后PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛-PBS固定液，4 ℃固定30 min；PBS沖洗后加入相應抗體，4 ℃避光染色30 min；再次進行PBS清洗，加入DAPI，室溫避光染色10 min即可。熒光顯微鏡下觀察，拍片，計數。

1.9流式細胞技術 ①設門：首先設立FSC-A/ FSC-H二維散點圖，選定細胞群P1，最大限度地排除細胞碎片；FSC-A/SSC-A二維散點圖中調節(jié)FSC和SSC電壓值，在P1門中圈出細胞群P2，即為目標細胞。②獲取結果：在目標熒光通路上檢測樣本的熒光強度。每份樣本檢測10 000個細胞，數據可用直

1.11統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，所有數據都以±s來表示，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-keuls檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。方圖或二維散點圖表示。所有數據用CytExpert或FlowJo 7.6軟件進行處理分析。

1.10PCR技術 ①引物序列：miR-340上游引物5’-GCGCTAGGTAGTTTCCTGTT-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTC CGAGGT-3’。②反應程序：95 ℃預變性2 min進入循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ l min，40個循環(huán)；進入融解曲線階段，60 ℃ l min，95 ℃ 15 s。③結果分析：將PCR得到的目的基因CT值與其對應的內參CT值相減進行第1次校正，得到目的基因的校正CT值（?CT），再以對照組中的?CT作為本底參數進行第2次校正，則目的基因的量為：2-??CT。④每次實驗重復3次，結果取平均值；每次擴增的同時設置無cDNA的陰性對照，當陰性對照的CT值小于35時，該次擴增數據棄去。

2　結果

2.1小鼠腹腔巨噬細胞和骨髓巨噬細胞純度鑒定

2.1.1熒光顯微鏡法：結果顯示小鼠腹腔巨噬細胞（見圖1A-C）和骨髓巨噬細胞（見圖1D-F）占所有細胞的90%以上，可用于實驗。

圖1　熒光顯微鏡鑒定小鼠原代巨噬細胞（×200）

2.1.2流式細胞術法：結果顯示骨髓巨噬細胞占所有細胞95%以上，可用于實驗（見圖2）。

2.2膿毒癥模型miR-340表達增高，而MaR1能抑制miR-340的誘導表達

圖2　流式細胞術鑒定小鼠骨髓巨噬細胞純度

2.2.1在體實驗：不同處理后收集血漿樣本，檢測miR-340表達情況（n=6）。與Sham組比較，CLP組miR-340表達明顯升高（P＜0.05）；與CLP組比較，CLP+ MaR1組miR-340表達顯著降低（P＜0.05），見圖3A。

2.2.2體外實驗：不同處理后收集細胞樣本，檢測miR-340表達量（n=7）。與control組相比，LPS 組miR-340表達升高（P＜0.05）；與LPS組比較，LPS+MaR1組miR-340表達降低（P＜0.05），見圖3B。

2.3小鼠骨髓巨噬細胞轉染miR-340 mimic可增強miR-340的表達

2.3.1轉染mimic實驗：骨髓巨噬細胞轉染miR-340 mimic后收集樣本，檢測miR-340表達情況（n= 6）。選取最佳轉染劑量50 nmol/L（P＜0.05）和最佳轉染時間48 h（P＜0.05），見圖4。

2.3.2轉染inhibitor實驗：骨髓巨噬細胞轉染miR-340 inhibitor后收集樣本，檢測miR-340表達情況（n=6）。結果顯示miR-340的表達量并沒有顯著下降（P＞0.05），見圖5。

2.4腹腔巨噬細胞和骨髓巨噬細胞轉染miR-340 mimic后，巨噬細胞吞噬能力下降

2.4.1熒光顯微鏡法：小鼠腹腔巨噬細胞轉染miR-340 mimic后收集樣本，用吞噬率或吞噬指數表示巨噬細胞吞噬能力。結果顯示miR-340能降低巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數（P＜0.05），見圖6。

2.4.2流式細胞術法：小鼠骨髓巨噬細胞轉染miR-340 mimic后收集樣本，用吞噬率或平均熒光強度表示巨噬細胞吞噬能力。

圖3　膿毒癥模型miR-340表達增高，而MaR1能降低miR-340的表達

圖4　小鼠骨髓巨噬細胞轉染miR-340 mimic的量效（A）與時效（B）

圖5 小鼠骨髓巨噬細胞轉染miR-340 inhibitor量效

FSC-A/FSC-H二維散點圖，選定細胞群P1（見圖7A）；FSC-A/SSC-A二維散點圖，圈出細胞群P2（見圖7B）；在熒光微球發(fā)射光的熒光通路（ECD）上檢測樣本的熒光強度，首先測定微球樣本，確定單個熒光微球在ECD-A/Count直方圖上的位置，即熒光強度（見圖7C），再檢測巨噬細胞樣本。數據可用直方圖（見圖7D）或二維散點圖（見圖7E）表示。結果顯示miR-340能降低巨噬細胞的吞噬率和平均熒光強度（P＜0.05），見圖7F-G。多樣本直方圖能直觀顯示出該結果（見圖7H）。

2.5臨床樣本血漿檢測，膿毒癥患者miR-340表達增強 膿毒癥患者入住重癥監(jiān)護室（接受治療前，尤其是抗生素治療）收集外周血樣本，檢測miR-340表達量（n=6）。結果顯示，與健康志愿者相比，膿毒癥患者的miR-340表達升高（P＜0.05），見圖8。

3　討論

本研究發(fā)現MaR1在CLP和LPS誘導的膿毒癥模型中通過調節(jié)miR-340發(fā)揮對巨噬細胞吞噬功能的調控作用。在體實驗（小鼠CLP模型）和體外實驗（LPS誘導的細胞膿毒癥模型）證實膿毒癥miR-340的表達量明顯增加，MaR1可以降低其表達；而且臨床膿毒癥患者血漿miR-340的水平也較健康志愿者明顯增高。同時，對小鼠原代巨噬細胞進行miR-340 mimic轉染，熒光顯微鏡和流式細胞儀的檢測結果均顯示miR-340能抑制巨噬細胞的吞噬功能。以往研究表明膿毒癥患者巨噬細胞功能受到抑制［9］，而MaR1能增強巨噬細胞的吞噬功能［7］。因此我們認為膿毒癥通過誘導miR-340的表達，抑制巨噬細胞的吞噬功能，進而引起膿毒癥的一系列病理生理改變，而MaR1可以逆轉這個過程，故我們認為MaR1對膿毒癥的治療及預后有一定的臨床意義。

膿毒癥的發(fā)病機制涉及病原微生物與宿主免疫、炎癥和凝血反應之間復雜的相互作用［10］。在膿毒癥的早期階段，產生過量的促炎介質，如TNF-α和IL-1β，引起自身損傷和多器官功能障礙。一直以來我們的治療策略為抗炎，但膿毒癥的病死率仍居高不下使得我們不得不反思膿毒癥的發(fā)生機制到底是什么。目前的觀點是機體產生代償性的抗炎反應來對抗過度的炎癥反應，構成了膿毒癥的晚期階段—免疫抑制［1］。而在免疫抑制階段中最重要的就是單核-巨噬細胞的功能受到抑制。有研究證實對免疫抑制狀態(tài)的膿毒癥患者使用干擾素-γ，可增強單核細胞的免疫功能，提高膿毒癥患者的生存率［11］。

圖6　熒光顯微鏡下檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球能力（×200）

Maresin是DHA經人巨噬細胞上12-LOX合成的脂質介質家族，在組織穩(wěn)態(tài)、炎癥消退、傷口愈合和機體防御方面具有重要作用。MaR1是該家族的第一位成員，與其他omega-3脂肪酸來源的介質（如保護素D1和消退素E1）相比，具有顯著的抗炎特性，如在酵母多糖誘導的腹膜炎模型中調節(jié)中性粒細胞浸潤和巨噬細胞吞噬功能［7］。MaR1還能通過調節(jié)巨噬細胞表型的轉化促進炎癥消退［12］。越來越多的文獻報道MaR1在各種疾病進程中的治療作用，如能通過抑制中性粒細胞的黏附和減少促炎因子的釋放減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷［13］，又能通過抑制上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）改善博來霉素引起的肺纖維化［14］，以及減輕四氯化碳誘導的小鼠肝損傷［15］。我們前期研究發(fā)現MaR1能降低小鼠中度CLP模型的24 h死亡率，對膿毒癥的預后有一定的指導意義。因此MaR1有望應用于臨床，成為治療膿毒癥的有效藥物。

MiRNAs是小的非編碼單鏈RNA，通過與靶mRNA 3’UTR完全或不完全配對，抑制靶mRNA的翻譯或者直接將其降解，于轉錄后水平對靶基因的蛋白表達進行調控。人類生物信息學預測miRNAs的靶基因非常廣泛，可以調控人類基因的30%以上，參與調節(jié)多種細胞過程，如細胞周期、凋亡、造血干細胞分化、新陳代謝及腫瘤轉移［16］。分析各類疾病及其不同病程中miRNAs的表達量，結果顯示在不同疾病或同種疾病的不同進程中，miRNAs表達量是有變化的，其中有顯著變化的miRNAs可能成為各種疾病診斷的生物學標記物以及治療的靶點。已有研究證實miR-25、miR-146、miR-150、miR-133a和miR-223可能作為膿毒癥的生物標記物［17］。我們的數據顯示膿毒癥miR-340的表達量顯著增高，證明miR-340也可作為膿毒癥的生物標志物及治療靶點；而MaR1能降低體內/體外膿毒癥模型中miR-340的誘導表達，說明MaR1可能通過調節(jié)miR-340的表達，改善膿毒癥的預后。

圖7　流式細胞術檢測小鼠骨髓巨噬細胞吞噬熒光微球能力

大量文獻證實miR-340可作為多種腫瘤的抑制物，與腫瘤的發(fā)生及轉移過程密切相關，也與細胞侵襲和轉移能力、細胞骨架重建相關。惡性組織與正常/良性組織相比miR-340的表達受到抑制，而降低miR-340的水平可導致腫瘤發(fā)生和轉移，如miR-340能抑制結腸直腸癌細胞的生長［18］，而骨髓中miR-340的低表達與結腸直腸癌的肝轉移有關［19］。miR-340可直接抑制靶基因ROCK1的表達來抑制骨肉瘤的增長和轉移［20］，又可以抑制靶基因RhoA參與紫外輻射誘導的樹突形成［21］；而ROCK1是RhoA小GTP酶的重要下游效應器，當ROCK1選擇性結合Rho GTP活性形式時被激活，而激活的ROCK1與肌動蛋白細胞骨架相互作用以促進肌動蛋白重組和細胞收縮［22］。因此我們推測miR-340能通過抑制RhoA/ROCK1的表達，抑制細胞的收縮，促進細胞伸出偽足進行吞噬。我們的結果顯示miR-340能抑制巨噬細胞吞噬熒光微球，補充實驗卻證實miR-340并不影響巨噬細胞吞噬細菌。這與巨噬細胞吞噬機制的復雜性密切相關。吞噬不同物質時，顆粒的性質不同，結合的受體各異，以及吞噬過程中啟動的信號通路也不盡相同［23］。巨噬細胞通過多病原相關分子模式（以Toll樣受體家族為成員）直接識別病原體，而對調理過的病原體則通過補體受體和Fc受體介導的識別模式。所以我們認為miR-340可能只影響補體受體或Fc受體介導的信號通路，從而影響巨噬細胞吞噬熒光微球。

圖8　膿毒癥患者血漿中miR-340表達明顯增加

最后，我們研究了增強miR-340的表達是否可以減弱MaR1對巨噬細胞吞噬功能的促進作用。小鼠骨髓巨噬細胞轉染miR-340 mimic（50 nmol/L 48 h）后，加入LPS（1 μg/mL）和/或MaR1（100 nmol/L）8 h，采用流式細胞技術檢測巨噬細胞吞噬熒光微球能力的變化。結果顯示，miR-340并不能降低MaR1對巨噬細胞吞噬功能的促進作用。我們認為MaR1可以通過很多途徑增強巨噬細胞的吞噬功能，而對miR-340的調節(jié)只是其中的一條途徑，各種通路之間進行交互作用，最終表現出整體效應。

總之，MaR1可逆轉CLP/LPS誘導膿毒癥中巨噬細胞吞噬功能的抑制，其作用可能與調節(jié)miR-340的表達有關。MaR1有可能成為膿毒癥的有效治療藥物，而miR-340則可能成為膿毒癥的生物標記物之一。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Maresin 1 strengthen macrophages phagocytosis via miR-340

XIE Haiqing，ZHANG Junli，XIE Xiang，JIN Shengwei. Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325027

Abstract:Objective: To investigate whether Maresin 1 （MaR1） could strengthen macrophage phagocytosis in sepsis model，and to explore the underlying mechanisms. Methods: Mouse peritoneal macrophages and bone marrow-derived macrophages （BMDMs） were assessed through detection of F4/80 expression by fluorescence microscopy and flow cytometry. MiR-340 expression was investigated under the treatment of MaR1 in CLP-induced and LPS-induced sepsis model in vivo and in vitro. MiR-340 expression in BMDMs transfected with miR-340 mimic or inhibitor was detected by quantificational real-time polymerase chain reaction （qRTPCR）. And then，the effect of miR-340 on phagocytosis of macrophage was investigated with fluorescence microscopy and flow cytometry. Finally，miR-340 serum concentration in sepsis patients and in healthy volunteers was measured. Results: Mouse peritoneal macrophages and BMDMs were consisted of approximately 90% as assessed by F4/80 expression. MiR-340 expression was up-regulated in LPS challenging and down-regulated with MaR1 administration in vivo and in vitro （P＜0.05）. MiR-340 expression was up-regulated in BMDMs transfected with miR-340 mimic，however dose not down-regulated in BMDMs transfected with miR-340 inhibitor. The phagocytosis of mouse peritoneal macrophages transfected with miR-340 mimic was suppressed by fluorescence microscopy （P＜0.05）； Similarly，the function of BMDMs transfected with miR-340 mimic was refrained by flow cytometry （P＜0.05）. MiR-340 serum concentration was elevated in sepsis patients （P＜0.05）. Conclusion: MaR1 can strengthen macrophage phagocytosis via miR-340 in sepsis.

Key words:Maresin 1； LPS； miR-340； sepsis； macrophages； phagocytosis； mice

通信作者：金勝威，教授，博士生導師，Email：jinshengwei69@ 163.com。

作者簡介：謝海青（1991-），女，浙江溫州人，碩士生。

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81570076）。

收稿日期：2016-03-23

［中圖分類號］R4

［文獻標志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.001