侯穎欽　呂 華*(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

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基于天然氨基酸的蛋白質(zhì)修飾

侯穎欽呂 華*
(北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

摘要：基于天然氨基酸的蛋白質(zhì)修飾種類繁多，由于在不同的氨基酸上所進行的修飾會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生不同的影響，所以科學(xué)家們一直在探索基于天然氨基酸特異的蛋白質(zhì)修飾策略。本文主要以半胱氨酸、酪氨酸和蛋白質(zhì)氮端特異修飾為例，簡要回顧目前基于天然氨基酸的蛋白質(zhì)化學(xué)的相關(guān)工作。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)修飾；天然氨基酸；半胱氨酸；酪氨酸

1 背景介紹

對蛋白質(zhì)進行化學(xué)修飾可以帶來新的性質(zhì)和功能，從而調(diào)控蛋白的生物活性。而事實上，蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的翻譯后修飾是十分常見的現(xiàn)象，能極大地增加蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性。比如蛋白特定氨基酸的乙?；?、甲?；?、磷酸化、磺酸化、泛素化和糖基化等，可以影響細胞的信號傳導(dǎo)、分化、遷移等活動[1]。因此，發(fā)展正交的化學(xué)反應(yīng)對蛋白質(zhì)中的天然氨基酸進行特異性修飾，具有重要的研究意義[2]。 由于蛋白質(zhì)含有多種不同的氨基酸側(cè)鏈官能團，為了保證修飾的特異性，這些反應(yīng)必須具有較好的官能團選擇性。此外，由于蛋白質(zhì)多級結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，對它們的修飾必須同時保證蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能不受破壞和影響。因此，在接近生理環(huán)境條件(≤37 ℃， pH 6–8，μmol·L–1濃度)下即可以進行的高效率、高特異性和高轉(zhuǎn)化率的化學(xué)反應(yīng)成為了此類反應(yīng)的首選[3,4]。

本文主要以半胱氨酸、酪氨酸和蛋白質(zhì)氮端氨基酸為例，總結(jié)近年來天然氨基酸特異性的蛋白質(zhì)修飾，并對該研究領(lǐng)域的發(fā)展方向做出展望。

2 天然氨基酸特異性的蛋白質(zhì)修飾

在蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，雖然半胱氨酸在數(shù)量上所占比例并不高，但是由于其具有顯著的親核性和氧化還原性，易于修飾，被廣泛應(yīng)用于蛋白的選擇性修飾。

基于半胱氨酸的蛋白質(zhì)修飾較為常用的方法包括二硫鍵的交換反應(yīng)(圖1a)[5]、烷基化(圖1b)[5]以及與馬來酰亞胺(圖1c)[6]或乙烯基砜(圖1d)[7,8]的麥克爾加成反應(yīng)。Brik等利用二硫鍵的交換反應(yīng)對α-球蛋白中的半胱氨酸進行修飾，在較為溫和的條件(pH 7.0)下，1 h即可達到42%的產(chǎn)率，但是由于該反應(yīng)可逆，所以轉(zhuǎn)化產(chǎn)率難以提高，并且新生成的二硫鍵在還原性環(huán)境中較易被破壞，從而降低蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物的穩(wěn)定性。因此，Brik等又利用α-鹵代羰基化合物(如碘乙酰胺等)與α-球蛋白中唯一的半胱氨酸反應(yīng)，對其進行修飾以提高蛋白質(zhì)修飾產(chǎn)物的穩(wěn)定性。此外，馬來酰亞胺和乙烯基砜與巰基的麥克爾加成反應(yīng)是非常經(jīng)典的修飾巰基的反應(yīng)。目前，很多市售的巰基反應(yīng)活性的熒光染料為馬來酰亞胺修飾。所以，這也是對蛋白質(zhì)中半胱氨酸修飾選擇性較好的修飾方法。

圖1　基于半胱氨酸的蛋白質(zhì)修飾的經(jīng)典反應(yīng)

其他基于半胱氨酸的蛋白質(zhì)修飾如圖2、圖3所示。根據(jù)所利用的化學(xué)反應(yīng)機理不同分為極性反應(yīng)和光催化反應(yīng)。

Baker小組和Caddick小組研究了半胱氨酸與溴代馬來酰亞胺的極性反應(yīng)，分別通過半胱氨酸的可逆烷基化(圖2a, 2b)和不可逆烷基化(圖2c)對蛋白質(zhì)進行修飾，不僅可以用于體外的蛋白質(zhì)反應(yīng)[9,10]，還可以在活細胞中對蛋白質(zhì)進行修飾[11]。而后，Caddick小組[12]通過兩步反應(yīng)利用2, 5-二溴代己二酰胺與半胱氨酸在較為溫和的條件下(21–37 ℃)反應(yīng)得到了較高的轉(zhuǎn)化率(>95%)。半胱氨酸也可以與缺電子的烯丙基酰胺/酯或者烯丙基酮等反應(yīng)生成乙烯基硫化物(圖2d)，這類反應(yīng)速度快，生物正交性好。 Che等[13]利用帶有銥配合物的烯丙基酰胺與半胱氨酸的反應(yīng)對BSA(半胱氨酸個數(shù)多達70個，其中約一半左右的半胱氨酸互相形成二硫鍵)和HSA(含有72個半胱氨酸，其中32個互相形成二硫鍵)成功修飾，形成蛋白-一銥配合物雜化體，可以通過磷光實現(xiàn)生物成像。Wagner等[14]則研究了圖2e中APN與半胱氨酸的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)這類反應(yīng)不僅反應(yīng)速度快，并且生成的產(chǎn)物穩(wěn)定性好，且在反應(yīng)過程中對半胱氨酸具有良好的選擇性。

圖2　基于半胱氨酸的蛋白質(zhì)修飾的極性反應(yīng)

圖3　基于半胱氨酸的蛋白質(zhì)修飾的光催化反應(yīng)

如圖3所示，在光催化反應(yīng)中，包括3種反應(yīng)，其中巰基-烯(thiol-ene)反應(yīng)最常用到。利用thiolene[15–17]或巰基-炔(thiol-yne)[18]反應(yīng)與蛋白質(zhì)的半胱氨酸進行偶聯(lián)時需要有自由基引發(fā)劑或者光激發(fā)反應(yīng)。Liu等[16]在利用thiol-ene反應(yīng)對蛋白進行乙?；瘶擞洉r通過蛋白質(zhì)的溶解性研究表明，thiolene反應(yīng)過程中自由基的產(chǎn)生并沒有導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，而Strieter等[17]在利用thiol-ene反應(yīng)研究泛素的不同數(shù)目聚體的功能與結(jié)構(gòu)時也發(fā)現(xiàn)，thiol-ene反應(yīng)本身對泛素的結(jié)構(gòu)與功能并沒有太大影響，而是在不同位置和取向的偶聯(lián)體對泛素在蛋白質(zhì)水解過程中的作用會有較大影響。因此，可以推測自由基的產(chǎn)生對蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)并沒有非常重要的影響。與thiol-ene蛋白質(zhì)修飾方法相比，thiolyne反應(yīng)可以進行兩次修飾，因此可以分別引入兩種不同的官能團，從而對蛋白質(zhì)進行雙官能團化修飾。

基于半胱氨酸的蛋白質(zhì)修飾方法種類豐富，但是被大家廣泛應(yīng)用的是半胱氨酸與馬來酰亞胺的反應(yīng)和thiol-ene反應(yīng)。由于絕大多數(shù)蛋白質(zhì)序列中均含有半胱氨酸，所以該修飾方法適用范圍廣泛。但是，半胱氨酸在蛋白質(zhì)中往往會形成二硫鍵，當在半胱氨酸上進行修飾時很可能會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或性質(zhì)有一定的影響。所以科學(xué)家們也在積極探索在其他氨基酸上進行修飾。

2.2基于酪氨酸的蛋白質(zhì)修飾

加州大學(xué)Berkeley分校的Francis小組和斯克里普斯研究所的Barbas小組在基于酪氨酸的特異性蛋白質(zhì)標記方面做出了很多工作(圖4)。Barbas和Francis等小組[19–21]利用帶有吸電子基團的重氮化合物與酪氨酸酚羥基的鄰位反應(yīng)生成偶氮化合物，反應(yīng)速度很快(<4 h)，條件溫和(pH 9.0, 4 ℃即可反應(yīng))，并且對酪氨酸的選擇性較好(圖4a)。2004年，F(xiàn)rancis小組[22]提出了圖4b所示的Mannich類型的酪氨酸修飾方法。這種方法反應(yīng)效率很高，并且條件溫和，三組分反應(yīng)使其能夠引入多種官能團。2011年，F(xiàn)rancis等[23]又利用硝酸鈰銨作為催化劑實現(xiàn)了對酪氨酸的選擇性修飾，反應(yīng)速度更快(<1 h)，且需要的底物濃度也比較低(圖4c)。關(guān)于酪氨酸的選擇性修飾還有酪氨酸酚羥基鄰位和雙鍵的反應(yīng)等，反應(yīng)效率均比較好[24]。

圖4　基于酪氨酸的蛋白質(zhì)修飾

基于酪氨酸的蛋白質(zhì)修飾反應(yīng)選擇性較好，而且主要利用的是側(cè)鏈酚環(huán)的富電子特性，所以從反應(yīng)機理上來看基本一致，反應(yīng)類型比較單一。

2.3基于天然氨基酸的蛋白質(zhì)N-端特異性修飾

基于蛋白質(zhì)N-端氨基酸的修飾主要分為兩類，一類以氨基修飾為主(圖5a, 5b)[25–27]，這類反應(yīng)通常對氨基酸種類的選擇性不大，雖然N-端的氨基和賴氨酸中ε-氨基的pKa不同，通過控制反應(yīng)體系的pH可以使其對氨基有一定的選擇性，但是仍然不能做到完全選擇性，例如圖5a為Wong和Che等[26]的研究工作，利用烯酮化合物與氨基的反應(yīng)對蛋白質(zhì)的N-端進行修飾，基本上只要N-端有游離的氨基即可進行修飾。此外，可以通過串聯(lián)反應(yīng)或者利用反應(yīng)本身對N-端氨基酸的選擇性來實現(xiàn)N-端氨基的選擇性修飾。如Francis等則利用磷酸吡哆醛將蛋白質(zhì)N-端氧化成雙羰基酮或醛，再與胺氧反應(yīng)進行修飾，在pH 7.5的條件下，數(shù)小時(4 h)內(nèi)就可以得到較高的轉(zhuǎn)化效率[25]，而后其又將磷酸吡哆醛換為具有同樣作用的兩個分子(稱為Rapoport's鹽)，對谷氨酸有一定的選擇性[27]。另一類則有一定的氨基酸選擇性，例如圖5c、5d所示， Neri等[28]利用醛與N-端半胱氨酸的成環(huán)反應(yīng)將帶有醛基的西馬多丁與N-端帶有半胱氨酸的單克隆抗體F8進行偶聯(lián)以實現(xiàn)藥物分子的靶向性輸運。Francis等[29]則利用金屬配合物作為催化劑，對N-端的脯氨酸進行修飾，如圖5d所示，反應(yīng)條件比較溫和，選擇性很好并且反應(yīng)效率很高。

圖5　基于天然氨基酸的蛋白質(zhì)N-端修飾

2.4基于其他天然氨基酸的蛋白質(zhì)修飾

賴氨酸是最傳統(tǒng)的用于蛋白質(zhì)修飾的氨基酸，然而由于蛋白質(zhì)上的賴氨酸數(shù)目眾多，這種方法通常無法很好地控制修飾的位點和數(shù)目，容易對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能帶來影響。Barbas等[30]發(fā)展了基于催化抗體 (catalytic antibody)的賴氨酸修飾方法，但是并不具備普適性?；谄渌烊话被嵝揎椀姆椒ㄑ芯枯^少，目前有關(guān)于絲氨酸[31]、色氨酸[32]等的修飾方法，但是較為單一，并且應(yīng)用較少。

3 總結(jié)與展望

基于天然氨基酸的蛋白質(zhì)修飾在最小程度上避免了對蛋白質(zhì)本身結(jié)構(gòu)的改變，以期最大程度利用蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，并且通過修飾基團對蛋白質(zhì)的性質(zhì)進行改善和提高。雖然這種利用蛋白質(zhì)本身具有的氨基酸進行蛋白質(zhì)修飾的方法簡單快速，但卻面臨著選擇性的問題。氨基酸選擇性和修飾位點與數(shù)量的選擇性一直是這類修飾方法所面臨的挑戰(zhàn)與問題，所以在蛋白質(zhì)的天然氨基酸修飾方面科學(xué)家們將繼續(xù)致力于選擇性修飾的研究，并且近年來已經(jīng)有很多利用非天然氨基酸進行蛋白質(zhì)修飾的方法產(chǎn)生[4,33,34]，這將為蛋白質(zhì)修飾帶來更多的選擇策略。

參 考 文 獻

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? 教學(xué)研究與改革?

Protein-Modification Based on Canonical Amino Acid

HOU Ying-QinLV Hua*
(College of Chemistry and Molecular Engineering, Peking University, Beijing 100871, P. R. China)

Abstract:Chemical modifications on certain amino acids can result in diverse effects on protein structures and functions. For this, numerous strategies have been developed for site-specific or residue-specific protein modifications. Here we summarize the latest progresses on proteinmodification based on canonical amino acids such as cysteine, tyrosine and N-terminus.

Key Words:Protein-modification; Canonical amino acid; Cysteine; Tyrosine

*通訊作者，Email: chemhualu@pku.edu.cn

doi:10.3866/pku.DXHX20160101www.dxhx.pku.edu.cn

中圖分類號：O6；G64