姜清明，屈平華，陳　茶，陳默蕊

(1.粵北第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東韶關 512028；2.廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東廣州 510006；3.南方醫(yī)科大學附屬潮州市中心醫(yī)院檢驗實驗中心,廣東潮州 521000)

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·論著·

1株抗酸陽性丙酸桿菌的分離和鑒定

姜清明1，屈平華2，陳茶2，陳默蕊3

(1.粵北第二人民醫(yī)院檢驗科，廣東韶關 512028；2.廣東省中醫(yī)院檢驗醫(yī)學部，廣東廣州 510006；3.南方醫(yī)科大學附屬潮州市中心醫(yī)院檢驗實驗中心,廣東潮州 521000)

摘要:目的對1株乳腺膿腫標本分離的緩慢生長革蘭陽性抗酸桿菌進行菌種鑒定。方法采用細菌的16S核糖體核糖核酸(rRNA)基因測序分析，結合細菌的菌體形態(tài)、生長特征、API 20A和手工生化實驗進行菌種鑒定。結果該菌為厭氧的、無芽孢、直或彎曲的多形性桿菌，革蘭和抗酸染色為陽性。血平板培養(yǎng)5 d形成直徑大于2 mm、米黃色、圓形、光滑、突起、邊緣整齊、β溶血性菌落。但16S rRNA基因測序分析發(fā)現(xiàn)，該菌與貪婪丙酸桿菌的同源性為100%，API 20A生化編碼為44365062，VP試驗的陽性，符合貪婪丙酸桿菌的特征。結論該乳腺膿腫的病原菌為貪婪丙酸桿菌，其抗酸染色陽性，為國內首次報道。

關鍵詞:丙酸桿菌；抗酸性；細菌鑒定；序列分析

抗酸陽性桿菌通常指的是結核分枝桿菌和其他一些非結核分枝桿菌(NTM)，其廣泛存在于水、空氣、土壤等醫(yī)院相關環(huán)境中，可引起肺結核、麻風、導管相關性血流感染、傷口感染?？顾彡栃詶U菌的典型特征是菌體含有大量脂質，主要為分枝菌酸，革蘭染色時結合結晶紫的能力差，甚至不著色，但采用抗酸染色時，其與石炭酸復紅結合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，并保持復紅的顏色。除分枝桿菌外，一些諾卡菌屬和棒狀桿菌屬細菌，以及其他一些放線菌也具有弱抗酸性，但較為少見。2011年，從1例分枝桿菌培養(yǎng)的乳腺分泌物標本中檢出1例抗酸陽性細菌，最初錯誤鑒定為快生長分枝桿菌，后經(jīng)16S rRNA基因測序，確定為貪婪丙酸桿菌，報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料門診患者，男，38歲，左乳腺表層潰瘍和深部蜂窩性組織炎，膿腫體積為(3×3×2.5)cm，穿刺有膿液。微生物檢查：膿液直接涂片發(fā)現(xiàn)抗酸陽性桿菌；細菌培養(yǎng)和分枝桿菌培養(yǎng)均檢出無芽孢、直或彎曲的、多形性的抗酸陽性桿菌，最初誤報為快生長分枝桿菌。臨床治療采用膿腔引流和頭孢西丁抗感染治療，預后不詳。

1.2儀器與試劑TE 9600基因擴增儀(珠海黑馬公司)；恒溫金屬浴器(杭州博日公司)；快速革蘭染色液和抗酸染液(Baso)；API 20A鑒定試條(法國梅里埃)；E-test紙條(安徽淮北宏遠)；Premix Ex Taq酶體系(大連Takara公司)；細菌16S rRNA基因擴增通用引物27f(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)與1492r(5′- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3′)由上海英韋創(chuàng)津廣州公司合成。

1.3細菌培養(yǎng)和形態(tài)學觀察傷口分泌物標本分區(qū)劃線接種血平板、普通巧克力、麥康凱平板，置于含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中35 ℃恒溫孵育，每天觀察平板的生長狀態(tài)。按常規(guī)的細菌檢驗方法，進行革蘭染色和抗酸染色，油鏡下觀察其菌體形態(tài)照相記錄。

1.416S rRNA基因擴增及測序鑒定采用堿裂解法提取細菌的基因組DNA。細菌16S rRNA基因的PCR擴增條件參考文獻[1]。擴增產物經(jīng)電泳檢測后送與上海英韋創(chuàng)津廣州公司進行擴增產物的純化及基因測序。獲得的16S rRNA基因序列在NCBI的GenBank庫中進行Blast同源性比對初步確定其分類位置。

1.5生化鑒定生化鑒定包括API 20A鑒定、伏-普(VP)實驗和厭氧生長實驗等，主要參考試劑說明書進行。

2結果

2.1細菌培養(yǎng)結果分離到1種革蘭陽性桿菌，菌體呈桿狀或弧狀；其生長速度緩慢，初次培養(yǎng)5 d在血平板上可形成直徑大于2 mm、米黃色、圓形、光滑、突起、邊緣整齊、β溶血性菌落；麥康凱平板上不生長；抗酸染色陽性見圖1(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.216S rRNA基因測序鑒定及結果分析擴增得到16S rRNA基因的全序列，大小約1 500 bp。PCR產物送與上海英韋創(chuàng)津廣州公司進行測序，由獲得的毛細管電泳峰譜來看，其基因序列的熒光峰圖正常，無雜帶、無背景信號干擾見圖2(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。以DNA MAN軟件對基因序列的拼接，得到1 394 bp的有效序列，以Blast(www.ncbi.him.nih.gov/blast)的16S rRNA序列庫(細菌和真菌)進行分析，顯示與貪婪丙酸桿菌DSM 4901(核酸登錄號NR 118647)相似率為100%，與丙酸丙酸桿菌DSM 43307(核酸登錄號NR 025277)相似率為99.4%，與丙酸桿菌屬其他種的相似度則均低于99.0%。按CLSI MM-18通用解釋標準，可初步鑒定為貪婪丙酸桿菌[2]，但需進一步排除丙酸丙酸桿菌。

2.3生化實驗結果和分析分離株為兼性厭氧菌，其在厭氧環(huán)境中生長優(yōu)于需氧環(huán)境，且VP試驗陽性，符合丙酸桿菌的特征。采用API 20A試驗，分離株吲哚實驗陰性、脲酶陰性、葡萄糖發(fā)酵實驗陽性、甘露醇發(fā)酵實驗陰性、乳糖發(fā)酵實驗陰性、蔗糖發(fā)酵實驗陽性、麥芽糖發(fā)酵實驗陽性、柳醇發(fā)酵實驗陽性、木糖發(fā)酵實驗陰性、阿拉伯糖發(fā)酵實驗陰性、明膠液化實驗陽性、七葉靈水解實驗陽性、甘油發(fā)酵實驗陽性、纖維二糖發(fā)酵實驗陰性、甘露糖發(fā)酵實驗陽性、松三糖發(fā)酵實驗陰性、棉子糖發(fā)酵實驗陰性、山梨醇發(fā)酵實驗陰性、海藻糖發(fā)酵實驗陽性、觸酶實驗陽性，生化編碼為44365062。分離株與相關菌種生化實驗的比較見表1。其中“+”為陽性、“-”為陰性、“V”為可變、“ND”為未檢測，相關菌株的試驗資料來自參考文獻[3]。

表1　分離株與丙酸桿菌相關菌種的生理生化特征比較

3討論

丙酸桿菌是一類厭氧的、不產生芽孢的革蘭陽性桿菌，正常存在于人體皮膚表面。該菌營養(yǎng)類型為異養(yǎng)厭氧型，但可以耐受微量氧氣，由于可發(fā)酵糖類產生乳酸和轉化為丙酸，故命名為丙酸桿菌[4]，VP實驗陽性是該菌的一個重要特征。臨床上，丙酸桿菌主要引起痤瘡和術后感染[5]；近年來，有多例貪婪丙酸桿菌引起乳腺炎的臨床報告[6-8]。在本例研究中，分離株為兼性厭氧革蘭陽性桿菌，VP試驗陽性，符合丙酸桿菌的特點，API 20A生化實驗結果與貪婪丙酸桿菌一致，且16S rRNA基因與貪婪丙酸桿菌相似率為100%，故可以確定為貪婪丙酸桿菌。

目前還沒有丙酸桿菌抗酸陽性的相關報道。就抗酸染色的原理來看，該膿液標本直接涂片抗酸陽性，可能與皮膚皮脂腺的油脂環(huán)境和丙酸桿菌致病特性有關。有研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡丙酸桿菌分泌的磷脂酶可以將人體皮脂中的三酰甘油降解為游離脂肪酸，使其黏附在細胞表面，并具有以下作用：(1)營養(yǎng)作用；(2)生物被膜保護作用；(3)在皮膚毛囊中的黏附和泊位作用。因此，痤瘡丙酸桿菌的脂肪酸被膜，可能是其與石炭酸復紅牢固結合而不被酸性乙醇脫色的主要原因[9-10]。從已有的文獻資料來看，丙酸桿菌可通過菌體形態(tài)和革蘭染色的著色情況、血平板溶血、厭氧生長、VP試驗等與其他抗酸陽性的分枝桿菌和諾卡菌進行區(qū)分：(1)丙酸桿菌為革蘭陽性桿菌，菌體微彎曲；諾卡菌亦為革蘭陽性桿菌，菌體可見分枝；分枝桿菌為著色不良的革蘭陽性桿菌。(2)丙酸桿菌可發(fā)酵葡萄糖產生丙酸(因故而命名為丙酸桿菌)，其VP實驗陽性，而分枝桿菌和諾卡菌的VP實驗為陰性。(3)丙酸桿菌為厭氧菌，而分枝桿菌和諾卡菌為嚴格需氧菌。(4)丙酸桿菌在血平板上通?？尚纬搔氯苎?，分枝桿菌和諾卡菌在血平板上通常不溶血。

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Characterization of one strain of acid-fasting Propionibacterium isolated from the breast abscess samples

JiangQingming1,QuPinghua2,ChenCha2,ChenMorui3

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondPeople′sHospitalofYuebei，Shaoguan，Guangdong512028,China;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,theGuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510006,China;3.LaboratoryMedicalCenter,ChaozhouCentralHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity,Chaozhou，Guangdong521000，China)

Abstract:ObjectiveTo identify one acid-fasting bacteria isolated from wound secretion of breast abscess.MethodsThe acid-fasting strain was identified by the morphological characteristics,API 20A strips,classical biochemical reaction,and 16S rRNA gene sequencing.ResultsCells of the strain was anaerobic,non-spore-forming,pleomorphic,straight or curved rods,which Gram and acid-fast stain both were positive.After incubation for 5 days on sheep blood agar,colonies were than 2 mm in diameter,circular,smooth,entire,bump,rice cream-like with β-hemolysis.The 16S rRNA gene sequences were 100% identity to Propionibacterium avidum.The API 20A profile was 44365062 with positive Voges-Proskauer test,which was also consistent to Propionibacterium avidum.ConclusionThe pathogens of breast abscess is Proionibacterium avidum,which is the first acid-fasting Propionibacterium reported in China.

Key words:Propionibacterium;acid-fast;bacteria identification;sequence analysis

(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.026

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1219-02

作者簡介：姜清明，男，副主任技師，主要從事臨床微生物研究。