喬文斌，冶　薇，黃艷春

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，新疆烏魯木齊 830011)

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·論著·

93例B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤患者骨髓受累的診斷分析*

喬文斌，冶薇，黃艷春△

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，新疆烏魯木齊 830011)

摘要:目的探討骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)與流式細(xì)胞在檢測B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)骨髓受累中的價值。方法B-NHL患者同時做骨髓涂片和流式細(xì)胞檢測。骨髓涂片經(jīng)瑞士吉姆薩染色，分類計數(shù)骨髓細(xì)胞；流式細(xì)胞檢測先處理樣本后加熒光染色，上機(jī)處理。結(jié)果93例B-NHL患者經(jīng)骨髓涂片檢測陽性者為11例，陽性率為11.8%；經(jīng)流式細(xì)胞檢測陽性者為27例，陽性率為29.0%，兩種方法比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在11例骨髓涂片陽性的樣本中，有1例經(jīng)流式細(xì)胞檢測為陰性。結(jié)論骨髓涂片和流式細(xì)胞檢測都是診斷B-NHL骨髓受累的重要方法，兩者各有優(yōu)勢，聯(lián)合運用兩種方法可為診斷B-NHL骨髓受累提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

關(guān)鍵詞:非霍奇金淋巴瘤;流式細(xì)胞檢測;骨髓受累

惡性淋巴瘤是一組起源于淋巴結(jié)和(或)結(jié)外部位淋巴組織的惡性腫瘤，分為霍奇金淋巴瘤(HL) 及非霍奇金淋巴瘤(NHL)。B細(xì)胞NHL(B-NHL)是NHL常見的一種類型[1]。淋巴結(jié)與淋巴組織遍布全身，淋巴液和血液在全身循環(huán)，故淋巴瘤可發(fā)生和侵犯身體的任何部位，其中骨髓是淋巴瘤常見累及部位，尤其是NHL骨髓侵犯較常見。目前，骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢查是診斷淋巴瘤患者骨髓受累的重要手段，但敏感度低且受很多因素影響易漏檢。由于淋巴瘤細(xì)胞單克隆性的特點[2]，用流式細(xì)胞儀對其輕鏈進(jìn)行分析從而得出骨髓中是否存在淋巴瘤細(xì)胞，進(jìn)而可判斷骨髓是否受累。本研究通過分析比較兩種方法在診斷B-NHL患者骨髓受累情況，從而為淋巴瘤患者骨髓受累的診斷提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料選取2014年1月至2015年6月本院血液內(nèi)科經(jīng)活檢病理組織學(xué)診斷初治為B-NHL 患者93例。其中男性51例，女性42例，年齡14～78歲，中位年齡57歲，其中維吾爾族9例、漢族67例、回族10例、哈薩克族7例；按世界衛(wèi)生組織(WHO)的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期14例，Ⅱ期23例，Ⅲ期19例，Ⅳ期37例。

1.2儀器與試劑CD19-PECY5/Kappa-FITC/Lambda-PE、溶血素及PBS液均來自美國BECKMAN COULTER公司。檢測使用美國BECKMAN COULTER公司的CYTomios FC500流式細(xì)胞儀。瑞氏吉姆薩染液及過氧化物酶(POX)組織化學(xué)染液均來自BASO公司。

1.3方法93例B-NHL患者的骨髓標(biāo)本需由經(jīng)驗較為豐富的臨床醫(yī)師進(jìn)行采集，抽取骨髓液0.2～0.3 mL置于載玻片上，快速涂片8張，送細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查；更換10 mL無菌注射器，抽取骨髓液1 mL，將抽取的骨髓標(biāo)本逐滴加入肝素抗凝管中混勻，送流式細(xì)胞實驗室檢查。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)樣本需當(dāng)日及時染色處理，流式細(xì)胞檢測標(biāo)本于4 h處理完畢。骨髓細(xì)胞學(xué)檢測樣本做瑞士吉姆薩染色，并同時作POX組織化學(xué)染色，然后對樣本進(jìn)行分類計數(shù)。所有需流式細(xì)胞檢測的抗凝骨髓標(biāo)本按如下方式處理：(1)將骨髓標(biāo)本用300目分子篩過濾。(2)用5 mL PBS液將骨髓標(biāo)本洗滌2遍。(3)取1支流式管，加入10 μL熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD19、Kappa、Lambda。(4)在上述試管中加入100 μL洗滌好的骨髓液，微型振蕩器混勻，避光室溫放置20 min。(5)加入溶血素500 μL，微型振蕩器混勻，避光室溫放置20 min。(6)加入500 μL PBS液，避光室溫放置10 min。(7)對流式細(xì)胞儀進(jìn)行常規(guī)質(zhì)量控制。(8)使用Beckman流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，實驗結(jié)果從流式細(xì)胞儀獲得并用流式細(xì)胞相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.4質(zhì)量控制為了保證實驗數(shù)據(jù)的可靠嚴(yán)謹(jǐn)及結(jié)果的可信性，減少實驗誤差，在本實驗過程中，骨髓形態(tài)學(xué)樣本由兩名經(jīng)驗豐富的形態(tài)學(xué)工作者檢驗，每個樣本的骨髓片分類計數(shù)200個細(xì)胞；流式細(xì)胞檢測嚴(yán)格遵循質(zhì)量控制原則：分析樣本前，對樣本及時正確處理，正確校準(zhǔn)和標(biāo)準(zhǔn)化實驗儀器。確保流式細(xì)胞儀激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異，保證樣品檢測時儀器處于最佳工作狀態(tài)。免疫熒光染色保證在室溫下進(jìn)行。操作過程中嚴(yán)格遵循試劑盒說明及操作流程。流式細(xì)胞儀的檢測由檢驗中心的專人負(fù)責(zé)，檢測過程完全在質(zhì)量控制的條件下完成。

1.5判斷標(biāo)準(zhǔn)骨髓涂片的細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，按照盧興國[3]骨髓涂片細(xì)胞分類中淋巴瘤細(xì)胞大于5%且小于或等于20%者診斷為NHL骨髓侵犯；淋巴瘤細(xì)胞大于20%者診斷為NHL合并白血病(淋巴瘤細(xì)胞白血病)為標(biāo)準(zhǔn)，判斷骨髓受累情況，診斷時都應(yīng)做POX組織化學(xué)染色。流式細(xì)胞檢測用CD19選擇B淋巴細(xì)胞，然后分析其輕鏈，選擇B淋巴細(xì)胞輕鏈κ/λ>6或小于0.3作為單克隆B淋巴細(xì)胞的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，判斷骨髓受累情況。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析，率的比較采用χ2檢驗。取檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩種檢測方法陽性情況比較93例B-NHL患者經(jīng)骨髓涂片陽性者為11例，陽性率為11.8%；經(jīng)流式細(xì)胞檢測陽性者為27例，陽性率為29.0%，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.467，P=0.004)，見表1。在11例骨髓涂片陽性的樣本中，有1例經(jīng)流式細(xì)胞檢測為陰性。

表1　93例B細(xì)胞NHL患者兩種檢測方法的比較[n(%)]

*：P<0.05，與流式細(xì)胞檢測結(jié)果比較。

2.2兩種檢測方法結(jié)果判讀情況

2.2.1骨髓形態(tài)學(xué)檢測93例B-NHL患者在形態(tài)學(xué)檢測方面，11例陽性的樣本中4例診斷為淋巴瘤細(xì)胞白血病，7例診斷為NHL骨髓侵犯。淋巴瘤細(xì)胞白血病患者的骨髓象表現(xiàn)為增生極度活躍，淋巴瘤細(xì)胞比值高(>20%)，細(xì)胞胞體大、核大、核型不規(guī)則，核染色質(zhì)疏松，部分細(xì)胞核中可見大小不等的核仁1～2個見圖1(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)；NHL 骨髓侵犯的患者骨髓象表現(xiàn)為增生活躍，淋巴瘤細(xì)胞數(shù)量較少(5%～20%)，細(xì)胞散在分布，形態(tài)描述同淋巴瘤細(xì)胞白血病患者見圖2(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.2.2流式細(xì)胞檢測93例B-NHL患者在流式細(xì)胞檢測方面，骨髓未受累的患者B細(xì)胞的數(shù)量較少，Kappa和Lambda的比值范圍為0.3～6,見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)；骨髓受累的患者B細(xì)胞的數(shù)量較多，并且Kappa和Lambda相差較大，比值遠(yuǎn)小于0.3或遠(yuǎn)大于6，見圖4(見《國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

3討論

NHL是一組來源于淋巴造血系統(tǒng)高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，其發(fā)病率比較高，一些地區(qū)NHL的發(fā)病率可以達(dá)到惡性腫瘤發(fā)病的前3位。近20年來其發(fā)病率和病死率在世界各地均呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢[5-6]。B-NHL是NHL常見的一種類型，較易發(fā)生骨髓受累，在臨床分期中骨髓是否受累起著關(guān)鍵性的作用，一旦骨髓受累，臨床上就將其分到Ⅳ期，因此，骨髓檢查是B-NHL患者診斷和治療過程中必不可少的檢測項目之一。

常用的骨髓檢測方法為骨髓穿刺涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，本研究的93例B-NHL患者在形態(tài)學(xué)檢測方面，陽性者為11例，陽性率為11.8%。國內(nèi)外有報道NHL患者的骨髓侵犯發(fā)生率為16%～75%[7-9]，本研究使用骨髓涂片學(xué)檢測的結(jié)果略偏低。分析原因，與以下幾方面有關(guān)：(1)取材部位及涂片的質(zhì)量。B-NHL患者在做過骨髓穿刺時通常選取的部位為髂后上棘，因該處取材較為安全，成功率高，然而有時部分患者骨髓侵犯的部位未必就在取材的部位；同時涂片的質(zhì)量也是一個不容忽視的因素，在涂片的操作中，一般找骨髓小粒比較豐富的區(qū)域進(jìn)行，且涂片選取的骨髓量較少，加之分析涂片時也是隨機(jī)選取玻片中部及尾部的部分區(qū)域進(jìn)行分類計數(shù)，若骨髓侵犯的量較少，容易造成漏診。(2)骨髓瘤細(xì)胞的形態(tài)特點。B-NHL的病理分型較多，有成熟型的，也有早期未成熟型的，如果患者的病理分型為成熟B淋巴細(xì)胞的型別，其骨髓象中淋巴瘤細(xì)胞與成熟的淋巴細(xì)胞很難辨識區(qū)別，如果侵犯的數(shù)量也不多，那么在形態(tài)學(xué)中就極易漏診。本研究方法的11例陽性樣本中4例診斷為淋巴瘤細(xì)胞性白血病，7例診斷為NHL 骨髓侵犯。在判斷為陰性的82例樣本中還有10例樣本，其淋巴瘤細(xì)胞比例未能達(dá)到5%，按照標(biāo)準(zhǔn)未能放入骨髓受累的患者中。

流式細(xì)胞技術(shù)具有高通量，多參數(shù)檢測的優(yōu)點，近年來越來多的被應(yīng)用到淋巴瘤的分型及診斷上來。B-NHL是一種單克隆增殖的免疫增殖性疾病，淋巴瘤細(xì)胞呈輕鏈限制性，僅表達(dá)單一的輕鏈(Kappa輕鏈或者Lamda輕鏈)，而正常B 淋巴細(xì)胞呈多克隆表型,既表達(dá)Kappa 輕鏈,又表達(dá)Lamda輕鏈。本研究利用流式細(xì)胞學(xué)的優(yōu)勢以及B-NHL淋巴瘤細(xì)胞單克隆性的特點，分析了93例B-NHL患者的骨髓樣本。按照輕鏈κ/λ>6或小于0.3作為單克隆B細(xì)胞的診斷標(biāo)準(zhǔn)分析得出陽性者為27例，陽性率為29.0%。在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，陰性的患者，其B細(xì)胞的數(shù)量較少，部分患者甚至還未達(dá)到1%，故而輕鏈的分析失去了價值。在陽性患者中其B細(xì)胞不僅數(shù)量多，其輕鏈的表達(dá)遠(yuǎn)超過判斷標(biāo)準(zhǔn)。

通過比較兩種方法在診斷B-NHL患者骨髓受累的情況，發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞檢測的陽性率高于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的陽性率。但在具體分析結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，有1例經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)檢測為陽性的患者，在流式細(xì)胞檢測中呈陰性，且輕鏈的表達(dá)較少，這是否與該患者B細(xì)胞表達(dá)輕鏈丟失有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實。兩種方法在診斷B-NHL患者骨髓受累時各有其優(yōu)勢，也有其不足，在具體診斷時應(yīng)合理選用，如有條件可以同時選用兩種方法。

NHL在臨床上按侵犯范圍分為4期，一旦骨髓受累及即屬于Ⅳ期，預(yù)后較差。所以，NHL是否出現(xiàn)骨髓浸潤對分析病情進(jìn)展、擬訂治療方案、評價預(yù)后都具有十分重要的作用。對于分期較晚患者，自體造血干細(xì)胞移植是治療B-NHL的重要手段，但若移植前骨髓已受累，并由于移植前治療不充分，移植物中仍有淋巴瘤細(xì)胞殘留，則會增加移植后淋巴瘤復(fù)發(fā)的可能性。因此準(zhǔn)確合理診斷B-NHL患者骨髓是否受

累對于正確分期、制定治療方案具有雙重意義。

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The analyse of examining the bone marrow involvement in ninety-three patients of non-Hodgkin′s lymphoma*

QiaoWenbin,YeWei,HuangYanchun△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi,Xinjiang830011,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the value of combined detection of bone marrow smear(BMS) and flow cytometry(FCM) to examine bone marrow involvement(BMI)of B cell non-Hodgkin′s lymphoma(B-NHL).MethodsPatients with B-NHL were detected by BMS and FCM simultaneously.Smears were stained with Wright-Giemsa′s staining to differentially count neoplastic cells and the processed sample with fluorescent staining for the FCM.Results93 cases of patients with B-NHL were detected.The detection rate of BMS and FCM were 11.8% and 29.0%.There was statistical difference of detection rate between the two method(P<0.05).In 11 cases patients of BMI with the method of BMS,while using the method of FCM 10 cases were positive.ConclusionBoth BMS and FCM are useful to diagnose BMI of B-NHL,each of them has individual characteristics.Combined detection of these two methods can increase the diagnostic of BMI.

Key words:non-Hodgkin′s lymphoma；flow cytometry；bone marrow involvement

(收稿日期：2016-01-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.007

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)09-1175-03

*基金項目：新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金資助項目(XJC201390)。

作者簡介：喬文斌，男，主管檢驗師，主要從事臨床血液學(xué)檢驗研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail：huangyanchun0619@sohu.com。