方良春，管世鶴，周　強(qiáng)，畢惠娟

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽合肥 230601)

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·論著·

慢性乙型肝炎患者趨化因子Mig表達(dá)水平的研究*

方良春，管世鶴△，周強(qiáng)，畢惠娟

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽合肥 230601)

摘要:目的研究慢性乙型肝炎患者中趨化因子Mig的表達(dá)水平。方法分別采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western-blotting分析88例慢性乙型肝炎患者和53例健康人群血清、外周單個(gè)核細(xì)胞及肝臟組織中Mig的表達(dá)水平，同時(shí)以免疫組化技術(shù)分析Mig在肝臟組織中的分布情況。 結(jié)果乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性乙肝患者血清、外周單個(gè)核細(xì)胞和肝組織中Mig表達(dá)量分別為(247.03±63.14)pg/mL、(0.95±0.21)、(0.79±0.23)，乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽(yáng)性乙肝患者血清、外周單個(gè)核細(xì)胞和肝組織中Mig表達(dá)量分別為(243.05±53.00)pg/mL、(0.98±0.35)、(0.74±0.18)，與健康人群血清、外周單個(gè)核細(xì)胞和肝組織中Mig表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論慢性乙型肝炎患者體內(nèi)Mig呈現(xiàn)較高的表達(dá)水平可能與患者機(jī)體狀態(tài)相關(guān)。

關(guān)鍵詞:肝炎病毒，乙型；趨化因子；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

乙型肝炎病毒(HBV)作為一種非細(xì)胞毒性的嗜肝病毒，感染機(jī)體后將導(dǎo)致急慢性肝炎、肝硬化、肝癌等一系列肝臟疾病的發(fā)生，嚴(yán)重危害人類健康[1]。其中，慢性乙肝是一種由HBV感染引起的以局部單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主的感染性疾病[2]。因此，趨化因子受體及其配體在慢性乙肝患者肝臟局部炎性反應(yīng)及病毒感染靶細(xì)胞清除方面發(fā)揮著重要作用[3]。Mig是一種含ELR序列的半胱氨酸-X-半胱氨酸趨化因子，能與免疫細(xì)胞表面CXC受體相互作用，通過(guò)產(chǎn)生肝臟的局部免疫應(yīng)答，呈現(xiàn)出慢性炎癥持續(xù)存在或慢性炎癥急性發(fā)作表現(xiàn)[4]。目前，在慢性乙型患者體內(nèi)HBV感染與Mig表達(dá)的相關(guān)性尚不清楚。為此，本課題研究Mig在乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽(yáng)性和乙型肝炎e抗原(HBeAg)陰性乙肝患者血清、外周單個(gè)核細(xì)胞和肝臟表達(dá)水平。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源收集2010年2月至2011年2月本院慢性乙型肝炎患者88例和健康者53例血樣本和肝組織活檢樣本。其中男43例，女44例，平均年齡為(43.3±12.4)歲。所有患者的臨床診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)2010年推薦的慢性乙型肝炎防治指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑基因擴(kuò)增儀ABI 2720型由美國(guó)ABI公司提供。Mig酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)試劑盒由法國(guó) DIACLONE公司提供。Trizol?RNA提取試劑盒和LipofectamineTM2000由自美國(guó) Invitrogen公司提供。基因擴(kuò)增試劑盒由大連寶生物工程有限公司提供。

1.3RT-PCR分析Mig細(xì)胞總RNA的提取采用Trizol試劑，操作按照試劑和說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以O(shè)ligo dT(18)為引物，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因Mig，磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件均為94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。

1.4免疫印跡(Western Blotting)分析Mig表達(dá)細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗3次，每孔加120 μL含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上反應(yīng)10 min，振蕩，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，收集上清液，取50 μL用于Broford蛋白定量。各組均取20 μL總蛋白經(jīng)seap值平衡上樣量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，80 mA電流2 h濕電轉(zhuǎn)，10%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，加1∶1 000稀釋的鼠單克隆抗體(SBA公司)過(guò)夜，PBS洗3次，加1∶20 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (北京中杉金橋公司)室溫孵育3 h，PBS漂洗3次，化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒檢測(cè)。將收集的上清液用ELISA法按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Mig表達(dá)量。

表1　引物序列

2結(jié)果

2.1健康人群、乙肝患者血清Mig的水平HBeAg陰性、HBeAg陽(yáng)性乙肝患者血清Mig水平分別為(247.03±63.14)pg/mL、(243.05±53.00)pg/mL，與健康人群(143.82±26.97)pg/mL比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2健康人群、乙肝患者外周單個(gè)核細(xì)胞Mig mRNA表達(dá)水平RT-PCR結(jié)果顯示，與健康人群Mig mRNA表達(dá)水平(0.62±0.14)相比， HBeAg陰性乙肝患者(0.95±0.21)、HBeAg陽(yáng)性乙肝患者(0.98±0.35)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

M為DL2000標(biāo)志物；1、3、5分別為健康人群、HBeAg陰性乙肝患者和HBeAg陽(yáng)性乙肝患者外周單個(gè)核細(xì)胞GAPDH；2、4、6分別為健康人群、HBeAg陰性乙肝患者和HBeAg陽(yáng)性乙肝患者外周單個(gè)核細(xì)胞Mig。

圖1健康人群、乙肝患者外周單個(gè)核細(xì)胞

Mig mRNA表達(dá)的電泳圖

2.3健康人群、乙肝患者肝臟組織Mig表達(dá)水平比較免疫組化結(jié)果顯示，正常肝組織僅可見(jiàn)少量棕黃色的Mig表達(dá)于肝細(xì)胞漿，HBeAg陰性乙肝患者和HBeAg陽(yáng)性乙肝患者除在肝細(xì)胞胞漿有Mig表達(dá)外，還在肝竇內(nèi)的炎性細(xì)胞有Mig的表達(dá)。進(jìn)一步運(yùn)用免疫印跡技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與健康人群(0.37±0.16)相比較、HBeAg陰性乙肝患者及HBeAg陽(yáng)性乙肝患者肝組織的Mig蛋白表達(dá)相對(duì)量分別為(0.79±0.23)和(0.74±0.18)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2(見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

3討論

HBV感染的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，目前認(rèn)為宿主免疫功能紊亂是其病理?yè)p傷的主要原因之一，其中乙型肝炎免疫異常有部分原因與趨化因子有關(guān)。當(dāng)HBV侵入機(jī)體后，在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生大量病毒抗原，可使機(jī)體免疫系統(tǒng)活化，產(chǎn)生并釋放各種趨化因子如Mig等，此過(guò)程可引起部分肝細(xì)胞損傷，介導(dǎo)局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，使病程慢性化[5]。

趨化因子Mig是CXC趨化家族的成員，主要趨化白細(xì)胞參與機(jī)體炎性反應(yīng)，同時(shí)Mig亦能影響巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞活性，在調(diào)節(jié)局部炎性反應(yīng)中起重要作用，具有廣泛的生物學(xué)活性，可能參與腫瘤血管形成、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂和調(diào)節(jié)宿主免疫功能等作用[6]。

本研究以ELISA、RT-PCR和Western-blotting等技術(shù)分析了88例慢性乙型肝炎患者在不同HBeAg狀態(tài)下的血清、外周單個(gè)核細(xì)胞和肝組織的Mig表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HBeAg陰性乙肝患者、HBeAg陽(yáng)性乙肝患者血清中Mig水平分別為(247.03±63.14)pg/mL、(243.05±53.00)pg/mL，顯著高于健康人群血清Mig水平(143.82±26.97)pg/mL。此外，無(wú)論是外周單個(gè)核細(xì)胞或者肝穿組織，HBeAg陰性乙肝患者和HBeAg陽(yáng)性乙肝患者的中Mig表達(dá)均高于健康人群。免疫組化技術(shù)分析提示在乙肝患者肝穿組織中，肝細(xì)胞中僅表達(dá)少量的Mig于肝細(xì)胞漿，而肝竇內(nèi)的炎性細(xì)胞表達(dá)大量Mig。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了HBeAg陰性乙肝患者和HBeAg陽(yáng)性乙肝患者血清、外周單個(gè)核細(xì)胞及其肝組織表達(dá)Mig的特點(diǎn)，為今后研究HBV的發(fā)病機(jī)制奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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The expression level of Mig in chronic hepatitis B patients*

FangLiangchun,GuanShihe△,ZhouQiang,BiHuijuan

(DepartmentofClinicalLaboratory,theSecondAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei,Anhui230601,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression levels of Mig in the patients with chronic hepatitis B.MethodsThe study population consisted of 88 chronic hepatitis B patients and 53 healthy controls.The ELISA,RT-PCR and Western-blotting were used for analysing the expression levels of Mig in serum,peripheral blood mononuclear cells and liver tissue of the patients with chronic hepatitis B,while the immunohistochemistry was applied for analysing the distribution of Mig in liver tissue.ResultsThe expression of Mig in serum,peripheral blood mononuclear cells and liver tissue of the chronic hepatitis B patients with HBeAg negative were (247.03±63.14)pg/mL，(0.95±0.21)，(0.79±0.23),and that in the chronic hepatitis B patients with HBeAg positive were (243.05±53.00)pg/mL，(0.98±0.35)，(0.74±0.18),which were both significantly higher than those in healthy controls,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionIncreased levels of Mig in the patients with chronic hepatitis B may be related to immune state of patients.

Key words:hepatitis B virus;chemotactic factor;enzyme linked immunosorbent assay

(收稿日期：2016-01-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.002

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)09-1164-02

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171662)。

作者簡(jiǎn)介：方良春，女，技師，主要從事實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡撸珽-mail:shiheguan@126.com。