宋玉霞　趙濤　張瑋璨　郭清　王宏衛(wèi)　孟桐羽

050011　河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(宋玉霞、趙濤、郭清、王宏衛(wèi)、孟桐羽)；河北醫(yī)科大學(張瑋璨)

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·論著·

卵巢癌SKOV3細胞系培養(yǎng)上清液處理巨噬細胞不同時間后對巨噬細胞分化的影響

宋玉霞趙濤張瑋璨郭清王宏衛(wèi)孟桐羽

050011河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科(宋玉霞、趙濤、郭清、王宏衛(wèi)、孟桐羽)；河北醫(yī)科大學(張瑋璨)

【摘要】目的探討卵巢癌SKOV3細胞系培養(yǎng)上清液處理巨噬細胞不同時間后，巨噬細胞分化亞型的改變。方法Ficoll 密度梯度法分離健康成人外周血單個核細胞，GM-CSF誘導為巨噬細胞(M0)后，用對數(shù)生長期的SKOV3細胞培養(yǎng)上清液處理為實驗組，用1640培養(yǎng)基處理為對照組，分別于培養(yǎng)第7天和第14天光學顯微鏡下觀察巨噬細胞形態(tài)變化；流式細胞術(shù)檢測實驗組和對照組在不同時間后巨噬細胞表面細胞因子(CD64、CD163)表達情況。結(jié)果培養(yǎng)第7天時，實驗組巨噬細胞形態(tài)改變明顯，細胞突起增加，細胞變細長，對照組細胞形態(tài)無明顯變化，實驗組CD64-M1型巨噬細胞所占比例高于對照組，CD163-M2型巨噬細胞所占比例低于對照組(P<0.05)；培養(yǎng)第14天時，實驗組巨噬細胞形態(tài)逐漸恢復，對照組細胞形態(tài)仍無明顯變化，實驗組CD64-M1型巨噬細胞所占比例低于對照組，CD163-M2型巨噬細胞所占比例高于對照組(P<0.05)。實驗組CD64-M1型巨噬細胞在第7天時M1/M0水平高于第14天，CD163-M2型巨噬細胞在第7天時M2/M0低于在第14天，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論SKOV3細胞培養(yǎng)上清液可改變巨噬細胞形態(tài)，激活巨噬細胞免疫反應(yīng)，隨著時間的推移，細胞形態(tài)恢復，發(fā)生免疫抑制；同時，也可促進巨噬細胞分化，隨著時間的推移，亞型也有不同，主要由CD64-M1型巨噬細胞向CD163-M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)變。

【關(guān)鍵詞】卵巢腫瘤；SKOV3；巨噬細胞；細胞分化

上皮性卵巢癌(簡稱卵巢癌)是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。由于缺乏早期特異性癥狀、無有效的疾病篩查手段，> 70%的病例確診時已是FIGO Ⅲ/Ⅳ 期的晚期癌癥患者，表現(xiàn)為腹腔內(nèi)廣泛播散和轉(zhuǎn)移。慢性炎癥能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并誘發(fā)不同類型的癌癥。炎癥微環(huán)境還有利于腫瘤細胞穿過基底膜，進而發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[1],因此近年來的一些研究集中于腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associateed macrophages，TAMs)。腫瘤相關(guān)巨噬細胞作為侵入實體腫瘤中單核細胞群的主要細胞，大量存在于腫瘤血管周圍和低氧區(qū)，是炎癥進展成為癌癥的主要橋梁[2]。卵巢癌中腫瘤相關(guān)巨噬細胞浸潤數(shù)量和卵巢癌預(yù)后不良明顯相關(guān)，逐漸開展了從免疫學角度研究卵巢癌轉(zhuǎn)移和進展的機制。之前一些研究發(fā)現(xiàn)，不同分期的卵巢癌患者腹腔巨噬細胞不同亞型所占比例不同，早期卵巢癌患者腹腔沖洗液中以表達M1型巨噬細胞為主，而晚期患者腹水中主要以M2型巨噬細胞占優(yōu)勢[3]。根據(jù)“免疫編輯”學說，免疫系統(tǒng)對腫瘤的作用隨腫瘤的進展不斷變化，提示我們不同亞型的巨噬細胞在卵巢癌進展中發(fā)揮不同的作用，對卵巢癌惡性表型有重要意義。鑒于巨噬細胞在卵巢癌中的重要作用，本項目擬利用細胞培養(yǎng)及流式細胞學等實驗技術(shù)，通過構(gòu)建卵巢癌細胞系SKOV3培養(yǎng)上清與巨噬細胞共培養(yǎng)模型，明確經(jīng)SKOV3培養(yǎng)上清培養(yǎng)后的巨噬細胞亞型的變化及巨噬細胞亞型改變與SKOV3培養(yǎng)上清培養(yǎng)時間的關(guān)系，探討卵巢癌細胞系SKOV3上清對巨噬細胞亞型的影響，初步了解卵巢癌進展過程中巨噬細胞亞型的改變，初步篩選出腫瘤上清中的關(guān)鍵分子靶點，為解釋卵巢癌的腹腔播散和轉(zhuǎn)移提供新的線索，并為卵巢癌分子靶點的干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料1640培養(yǎng)基，卵巢癌細胞系SKOV3。

1.2方法

1.2.1采集健康成人外周血，F(xiàn)icoll 密度梯度法收集中間層單個核細胞(1 000 r/min， 20 min，23℃)， PBS 重懸后再次離心(800 r/min， 7 min， 23℃)。用對數(shù)生長期的SKOV3細胞培養(yǎng)上清液處理為實驗組，1640培養(yǎng)基處理為對照組。

1.2.2巨噬細胞培養(yǎng)：細胞以無血清RPMI1640重懸后種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，細胞種植密度為1.0×106/ml，培養(yǎng)箱中靜置 2 h 使細胞貼壁，用預(yù)熱的PBS潤洗3次，除去懸浮細胞。加入10%FBS-RPMI1640和GM-CSF，置入37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，備用。

1.2．3用對數(shù)生長期的SKOV3細胞培養(yǎng)上清分別處理7、14 d：處理不同時間后，光學顯微鏡下觀察巨噬細胞形態(tài)變化。

1.2.4腹腔巨噬細胞(M0)純度鑒定：以免疫熒光的方式鑒定分離培養(yǎng)巨噬細胞純度。細胞刮輕刮培養(yǎng)皿收集巨噬細胞，離心收集細胞沉淀1 200 r/min， 5 min，23℃。棄上清，以CD68抗體標記巨噬細胞，37℃，1 h。PBS洗滌3遍，標記熒光二抗，37℃，1 h。PBS洗滌3遍，Hocest染核5 min。PBS洗滌3遍，熒光顯微鏡觀察，統(tǒng)計。

1.2.5SKOV3細胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細胞：用對數(shù)生長期的SKOV3細胞培養(yǎng)上清分別處理M0巨噬細胞7、14 d，同時用1640培養(yǎng)基設(shè)立對照組。

1.2.6巨噬細胞各亞型比例的檢測：以CD68作為腹腔巨噬細胞(M0)的表面標記，以CD64作為M1型巨噬細胞的表面標記，以CD163作為M2型巨噬細胞的表面標記。將對照組和實驗組不同處理時間的細胞分別收集，取1.0×106個細胞，分別標記上述熒光抗體，流式細胞學檢測M1、M2所占百分比及M1/M0，M2/M0的比例。

2結(jié)果

2.1SKOV3細胞培養(yǎng)上清處理7 d的巨噬細胞形態(tài)改變明顯，如細胞呈多邊形或長梭形，形態(tài)飽滿，胞質(zhì)豐富，生長旺盛，細胞突起增加，細胞狀態(tài)良好；處理14 d的巨噬細胞形態(tài)改變不明顯，細胞呈圓形，散在排列。說明SKOV3細胞上清處理巨噬細胞7 d時可改變細胞形態(tài)；而處理14 d時對細胞形態(tài)改變不明顯。見圖1。

對照組實驗組

圖1用1640培養(yǎng)基和SKOV3細胞培養(yǎng)上清處理巨噬細胞7、14 d后，在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化(100×免疫熒光)

2.2流式細胞術(shù)檢測實驗組、對照組不同巨噬細胞亞型所占比例。

2.2.12組不同巨噬細胞亞型所占比例比較：培養(yǎng)7 d時，對照組CD64-M1型巨噬細胞占(15.4±2.3)%，CD163-M2型巨噬細胞占(2.0±0.7)%；實驗組CD64-M1型巨噬細胞占(24.2±2.9)%，CD163-M2型巨噬細胞占(1.4±0.5)%；培養(yǎng)14天時，對照組CD64-M1型巨噬細胞占(3.8±0.9)%，CD163-M2型巨噬細胞占(3.3±1.3)%；實驗組CD64-M1型巨噬細胞占(1.9±0.9)%，CD163-M2型巨噬細胞占(11.5±1.4)%。2組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1　2組不同巨噬細胞亞型所占比例比較　±s

注：與對照組比較，*P<0.05

圖2　2組不同巨噬細胞亞型所占比例

2.2.22組不同巨噬細胞亞型比值比較：CD64-M1型巨噬細胞在第7天時M1/M0=(1.61±0.29)，在第14天時M1/M0=(0.52±0.13)；CD163-M2型巨噬細胞在第7天時M2/M0=(0.73±0.19)，在第14天時M2/M0=(3.56±1.10)；差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，圖3。

表2　2組的不同巨噬細胞亞型的比值比較　±s

注：7 d時比較，*P<0.05

圖3　2組的不同巨噬細胞亞型的比值

3討論

卵巢癌是致命性最高的婦科惡性腫瘤[4]。我國卵巢癌發(fā)病雖位于女性腫瘤第三位，但病死率卻居于首位，超過70%的患者確診時已有腹膜轉(zhuǎn)移，5年生存率不到30%[5,6]。近年來，卵巢癌與免疫微環(huán)境相互作用的研究與日俱增，尤其與巨噬細胞的關(guān)系成為研究熱點，但是關(guān)于腹腔巨噬細胞的研究仍處于初級階段。因此，闡明不同分期卵巢癌腹腔巨噬細胞的狀態(tài)可能為卵巢癌惡性進展提供新的線索。

人正常腹腔微環(huán)境中存在大量免疫細胞尤其是巨噬細胞，巨噬細胞作為第一道免疫防線——固有免疫的主要細胞成分對維持腹腔正常免疫環(huán)境有非常重要的作用[7]。晚期卵巢癌以腹腔廣泛種植播散和大量腹水為主要臨床特征。在卵巢癌腹腔種植播散的過程中，巨噬細胞與腫瘤細胞存在一定的相互作用，從而影響腫瘤細胞的惡性表型和不良轉(zhuǎn)歸[8]。

不同學者對卵巢癌腹腔播散發(fā)生機制提出各自看法，但基本集中在原位卵巢癌腫瘤細胞發(fā)生上皮細胞間質(zhì)型(EMT)自原位脫落，進入腹腔，抵抗失巢凋亡，到達大網(wǎng)膜、腸系膜、腸壁、腹壁等播散位置后，黏附種植，發(fā)生MET，局部浸潤播散。大多數(shù)學者對其研究多偏重于卵巢癌細胞自身的DNA、RNA、蛋白水平為適應(yīng)播散做出的一系列改變。但關(guān)于腹腔微環(huán)境尤其是免疫微環(huán)境對卵巢癌腫瘤細胞的改造報道較少，而這正是闡明卵巢癌腹腔播散的關(guān)鍵，是我們有待進一步研究的方向。

目前臨床中，晚期卵巢癌的治療仍然以手術(shù)加以紫杉醇加鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療為主要手段。雖然大幅提高卵巢癌初始化療的效果，但是對復發(fā)性卵巢癌的治療尚無重大突破。近年來，對于惡性腫瘤的治療出現(xiàn)了一些分子靶向治療藥物，如Herceptin,Gleevec,Sorafenib等。但是卵巢癌的分子靶向治療藥物仍未獲得突破性進展。分子靶向藥物在臨床應(yīng)用中暴露的一些問題使得人們逐漸把目光轉(zhuǎn)移到生物免疫治療上來。腹腔巨噬細胞與卵巢癌腫瘤細胞相互作用的研究，對揭示卵巢癌惡性表型有重要意義，同時還能對卵巢癌的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

外周血單核細胞是一種重要的非特異性免疫細胞。這些細胞能感知癌癥入侵信號，移出毛細血管，并轉(zhuǎn)化為未成熟型巨噬細胞M0[9]，M0滲透到癌灶組織周圍，并被激活，從而殺死腫瘤細胞，這些細胞即被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)。TAMs是構(gòu)成實體腫瘤中單核細胞群的主要細胞，大量存在于腫瘤血管周圍、無血管區(qū)和低氧區(qū)，是炎癥發(fā)展成癌的主要橋梁[10]。然而，并非所有的TAMs均可發(fā)揮其殺傷腫瘤細胞的功能。TAMs分為兩種功能截然相反的兩組表型，經(jīng)典激活型TAMs，即M1型TAMs，能夠誘導干擾素和腫瘤壞死因子產(chǎn)生細胞毒素殺傷腫瘤細胞[3]。M2型TAMs可被轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、白介素-4(IL-4)和(IL-13)激活，為腫瘤細胞提供 “營養(yǎng)支持”[11]。M1型和M2型關(guān)鍵區(qū)別在于它們分泌的細胞因子不同。M1型TAMs能夠釋放活性氧、炎性細胞因子，比如IL-6、IL-12、IL-23和腫瘤壞死因子(TNF)，從而殺死腫瘤細胞，其主要由干擾素、脂多糖、腫瘤壞死因子、粒-巨噬細胞集落刺激因子活化。M2型TAMs則釋放各種生長因子，如表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，從而促進血管的形成和腫瘤的生長[12]。而癌細胞也分泌一些“M2型”細胞因子，比如IL-10、VEGF、血小板衍生生長因子等來誘導M0型向M2型分化[13]，因此，癌組織中常見的即是M2型TAMs[14]。M2型巨噬細胞還能夠抑制TH1獲得性細胞免疫，可以促進創(chuàng)傷愈合、血管增生、組織重塑等[15-17]。M2型巨噬細胞也能夠釋放免疫抑制因子(IL-10、TNF-β1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2，9)等，促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成以及誘導局部免疫耐受從而促進腫瘤進展。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中，卵巢癌細胞蔓延到腹膜表面，引起腹膜毛細血管通透性及再吸收功能障礙，血管內(nèi)單核-巨噬細胞在各種免疫因子的刺激下滲出腹膜，促進腹水形成。大量的單核-巨噬細胞在腹腔微環(huán)境中分化為M1、M2型巨噬細胞，并分泌各種細胞因子參與腫瘤的轉(zhuǎn)移及腹水形成[18,19]。其中，IL-8參與卵巢癌腹水的形成，并通過促進其他炎性因子的釋放，促進腫瘤細胞的增殖和血管的生成[20]。IL-8還可以提高內(nèi)皮細胞的存活率、增值能力及MMP的分泌，從而調(diào)節(jié)血管生成[21]。M2型TAMs細胞表達細胞表面標記如CD163、CD204、CD206，M1型則表達CD64等。Lan等[22]研究110例晚期卵巢癌患者的M2型巨噬細胞表面的CD163分子，結(jié)果證明高表達CD163的患者無進展生存期及總生存期較低表達CD163的患者明顯縮短。血清中較高的CD163水平也提示預(yù)后不良[23]。同樣，另一個M2型TAMs相關(guān)標記物CD206的高表達也提示預(yù)后不良。但是單獨的CD206+并不能直接作為診斷依據(jù)，CD206/CD68比值的增高與患者的無進展生存期密切相關(guān)[24]。也有越來越多的研究證明，M1/M2比值升高可以提高患者的生存期[25]。這些研究告訴我們，CD68+巨噬細胞細胞的總數(shù)并不影響患者的預(yù)后，而是M1/M2比值與患者預(yù)后密切相關(guān)。

本實驗用SKOV3細胞培養(yǎng)上清模擬卵巢癌患者腹腔微環(huán)境，可以觀察到培養(yǎng)7 d時，主要是CD64-M1型巨噬細胞；培養(yǎng)14 d時，主要是CD163-M2型巨噬細胞。根據(jù)結(jié)果結(jié)合文獻報道，可以猜測，在卵巢癌的早期階段，主要以M1型巨噬細胞為主，可以促進TH1型細胞免疫，抑制腫瘤的進展。隨著腹腔微環(huán)境的變化，巨噬細胞在癌細胞釋放的“M2型”細胞因子的誘導下，逐漸向M2型分化，M2型巨噬細胞則促進腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成以及誘導局部免疫耐受從而促進腫瘤進展。但腹腔微環(huán)境變化具體細微過程仍然沒有能夠直接明確的觀察到，更多的細節(jié)過程有待進一步實驗證明。

巨噬細胞不僅參與非特異性免疫反應(yīng)，還參與特異性免疫應(yīng)答。傳統(tǒng)的免疫學認為，TAMs的出現(xiàn)能夠有效地發(fā)揮殺瘤作用，但如今看來，越來越多的研究表明，TAMs不僅不能清除腫瘤，反而主動抑制免疫應(yīng)答，促進了腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移。如何減少TAMs，如何誘導M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞分化，或者阻止MI向M2分化，進而改變腹腔微環(huán)境，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及遷移，對這些問題的研究將有助于了解TAMs與腫瘤細胞的關(guān)系，并研究出新的治療癌癥的方法。

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Effects of macrophage treated by culture supernatant with ovarian cancer SKOV3 cell line at different time points on the differentiation of macrophages

SONGYuxia*,ZHAOTao*,ZHANGWeican,etal.

*DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of differentiation subtypes of macrophages treated by culture supernatant with ovarian cancer SKOV3 cell line at different time points.MethodsThe peripheral blood mononuclear cells were separated from healthy adults by Ficoll density gradient method, which were induced into macrophages (M0) by GM-CSF.The culture supernatant in which the macrophages were cultured in medium with SKOV3 ovarian cancer cells at exponential growth phase was served as experimental group, however, the culture supernatant with macrophages in 1640 medium was served as control group. The morphological changes of macrophages were observed under microscope on the 7th day and 14th day,respectively, and the expression levels of the cytokines on surface of macrophages including CD64-M1 and CD163-M2 were detected by flow cytometry in different time points.ResultsThe morphous of macrophages was obviously changed on the 7th day after cultivation in experimental group,with cellular apophysis being increased and cells becoming long and thin, however, the morphous of macrophages was not obviously changed in control group. The proportion of CD64-M1 macrophages in experimental group was significantly lower than that in control group (P<0.05),however, the proportion of CD64-M2 macrophages in experimental group was significantly higher than that in control group (P<0.05) . On the 14th day after cultivation the morphous of macrophages was gradually recovered in experimental group,however, the morphous of macrophages was still not obviously changed in control group. Moreover the proportion of CD64-M1 macrophages in experimental group was significantly lower than that in control group (P<0.05),however, the proportion of CD64-M2 macrophages in experimental group was significantly higher than that in control group (P<0.05).The ratio of M1/M0 of CD64-M1 macrophages in experimental group on the 7th day was significantly higher than that on the 14th day (P<0.05),however, which in CD163-M2 macrophages on the 7th day was significantly lower than that on the 14th day (P<0.05).ConclusionThe cell culture supernatant treated by SKOV3 cells can change the morphous of macrophages and activate immune reaction of macrophage,with the time goes on, the morphous of cells will be recovered,with immunosuppression.Moreover the cell culture supernatant treated by SKOV3 cells can also promote the differentiation of macrophages, with the time goes on,different subtypes will appear,especially,CD64-M1 macrophages are differentiated into CD163-M2 macrophages.

【Key words】ovarian neoplasms;SKOV3;macrophages;cell differentiation

(收稿日期：2015-10-21)

【中圖分類號】R 737.31

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)10-1498-05

通訊作者：郭清,050011河北省石家莊市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.016

E-mail：yfguoqing@163.com