張文靜

430100　湖北省武漢市蔡甸區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科

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·論著·

乳腺癌中CDC25A和P57kip2蛋白表達與病理分級及臨床分期的關系

張文靜

430100湖北省武漢市蔡甸區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科

【摘要】目的探討CDC25A和P57kip2蛋白在乳腺癌中的表達與病理分級、臨床分期的關系，并對CDC25A和P57kip2之間的相關性進行研究。方法選擇免疫印跡方法對64例乳腺癌患者進行檢測，對CDC25A和P57kip2 蛋白在乳腺癌中的表達、病理特征以及臨床分期三者之間的聯系進行確切的研究探討。結果乳腺癌以及癌細胞周圍的正常細胞中都能夠找CDC25A蛋白的表達，但在乳腺癌中則表現為高密度表達(P<0.05)；腫瘤的分化程度越低，CDC25A蛋白的表達逐漸提升(P<0.05)。CDC25A 蛋白表達在臨床Ⅰ期、Ⅱ期，是否伴有淋巴結轉移間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。P57kip2蛋白在乳腺癌中呈低水平表達，在癌旁正常腺體中均呈高表達(P<0.05)，但在伴和不伴淋巴結轉移中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論CDC25A的過度表達和P57kip2的低表達可能在乳腺癌的發(fā)生中起作用；乳腺癌發(fā)生機制中有涉及細胞周期調節(jié)環(huán)路中的CDC25A、P57kip2基因的異常；CDC25A及P57kip2可能成為乳腺癌的診斷標記，預后判斷。

【關鍵詞】乳腺癌；細胞分裂調控25磷酸酶A；P57kip2蛋白；免疫印跡

目前筆者尚未發(fā)現國內有關CDC25A及P57kip2與乳腺癌之間關系的相關報道，但研究表明P57kip2阻止底物磷酸化，將細胞阻滯于G1期，抑制細胞增殖，而CDC25A能消除Thr-14和Tyr-15的抑制性磷酸化，促進G1/S期的進行，對細胞的運轉起正性調控作用[1-3]。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個長時間、多步驟、多階段并涉及多基因改變的逐步演進的過程，其發(fā)生發(fā)展需多個基因的異常，而在此過程中是否存在CDC25A 及P57kip2的功能紊亂，其具體機制尚不明確[4,5]。為此，本研究采用免疫印跡法(westorn blot)為實驗平臺，檢測乳腺癌組織、癌旁正常乳腺腺體組織中CDC25A及P57kip2的表達情況，并分析它們與乳腺癌病理分級、臨床分期、淋巴結轉移等臨床病理因素之間的關系，探討其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的影響以及它們之間的相互作用關系。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院2011年9月至2012年6月64例乳腺癌(標本經病理證實)患者的組織標本，患者均為原發(fā)性腫瘤，術前均未接受過放化療。64例均為女性，年齡38～81 歲，平均年齡(51±5)歲。腫瘤組織按癌細胞的分化程度(WHO 病理分級)分為Ⅰ級(n=7)、Ⅱ級(n=48)、Ⅲ級(n=9)3個試驗組；淋巴結轉移：無轉移29 例，有轉移35 例；按國際抗癌聯盟(UICC)分期：Ⅰ期11 例，Ⅱ期34 例，Ⅲ期19 例。對照組中屬于癌細胞旁的正常腺體組織，然后隨機選擇之后作為乳腺改良根治手術以后的病例標本，大約距離腫瘤3 cm以上的乳腺腺體組織標本10 例(經病理證實為正常乳腺腺體)。取材后置入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑與儀器

1.2.1抗體：兔抗人CDC25A 多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人P57kip2多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人 β-actin (武漢博士德生物工程有限公司)；硝酸纖維素膜(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2.2儀器：蛋白電泳儀(DYCZ-24D 型)；核酸電泳儀(北京六一公司)；流式細胞儀(FCM，becton dickinson 公司)；凝膠電泳成像分析系統(tǒng)(alphainnotech chemi imager,美國)；DYY-4OB 型轉印電泳槽(北京六一儀器廠)；可見-紫外分光光度計(U-2000，Hitachi 公司，Japan)；硝酸纖維素膜電轉系統(tǒng)(Bio-Rad 公司)。

1.3試驗方法

1.3.1Western blot法：對64 例乳腺癌組織和10 例癌旁正常腺體，均選取50 mg組織，冰上將組織置于10 ml離心管中,用消毒過的剪刀將組織塊盡量剪碎。參照文獻[5]方法進行操作用酶標儀測定A562，根據標準曲線來計算樣品的蛋白濃度。

1.3.2SDS-PAGE電泳：參照文獻[5]方法進行操作，然后利用顯影技術進行定影處理，并對最終的結果進行詳細的觀察研究，并利用圖像采集系統(tǒng)對圖像進行收集。

2結果

2.1CDC25A 蛋白在各組中的表達及其與乳腺癌的關系對于全部的組織來說，都具有CDC25A 蛋白的表達，但是在乳腺癌組織中則表現為高水平的表達，且在乳腺癌各病理分級，Ⅰ期、Ⅱ期，伴或不伴淋巴結轉移間的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在Ⅱ期，Ⅲ期分期間吸光度定量分析差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。CDC25A蛋白在乳腺癌組織中各病理分級間的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且CDC25A在乳腺癌組織及癌旁正常腺體組織相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；對于癌細胞旁的正常腺體組織以及乳腺癌組織中的CDC25A蛋白來說，其Ⅰ期和Ⅱ期的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但在Ⅱ期、Ⅲ期分期間吸光度定量分析差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；CDC25A蛋白在有或無淋巴結轉移的乳腺癌組織和癌旁正常腺體組織的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖1。

表1　CDC25A在乳腺癌組織各病理分級和對照組的表達　±s

注：與對照組比較，*P<0.05；與Ⅰ級(期)比較，#P<0.05；與無淋巴結轉移比較，△P<0.05

各病理分級間的表達

按UICC的TNM分期間的表達

伴或不伴腋窩淋巴結轉移的表達

圖1CDC25A 和β-actin 蛋白在癌旁正常腺體組織和乳腺癌中各病理分級間、UICC的TNM分期間、伴或不伴腋窩淋巴結轉移的表達

2.2P57kip2蛋白在各組中的表達和乳腺癌的關系P57kip2蛋白在癌旁正常乳腺組織中大量表達，在乳腺癌組織中呈低表達，且在乳腺癌各病理分級，分期的表達差異較明顯，在伴或不伴腋窩淋巴結轉移間吸光度定量分析差異不明顯。P57kip2蛋白在乳腺癌組織中各病理分級間的表達差異明顯，且P57kip2在癌細胞的正常腺體以及乳腺癌組織中相比較可以發(fā)現，兩者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；P57kip2蛋白乳腺癌組織中各臨床分期中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；P57kip2蛋白在有或無淋巴結轉移的乳腺癌組織和癌旁正常腺體組織的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但在乳腺癌組織中有或無淋巴結轉移間吸光度定量分析差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2，圖2。

表2　P57kip2在各組織中的表達及乳腺癌的關系　±s

注：與對照線比較，*P<0.05；與Ⅰ級(期)比較，#P<0.05

圖2P57kip2和β-actin 蛋白在癌旁正常腺體組織和乳腺癌中各病理分級間、UICC的TNM分期間、伴或不伴淋巴結轉移的表達

3討論

本研究顯示，在乳腺癌中CDC25A的表達顯著高于癌旁正常腺體組織，CDC25A蛋白在癌旁正常腺體組織中和乳腺癌組織中各病理分級及臨床分期中Ⅰ期、Ⅱ期的表達存在正相關，CDC25A蛋白在癌旁正常腺體組織中，有或無淋巴結轉移的乳腺癌組織中同樣存在正相關，這都進一步證實CDC25A的過表達與乳腺癌發(fā)生和早期的發(fā)展息息相關，并且過表達提示預后不良，或者是預后不良的危險因素之一，Ⅱ、Ⅲ期的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能提示CDC25A只在乳腺癌發(fā)展的早期起作用，在中晚期的作用不明顯，也有可能還需要更多更大范圍的實驗研究來進一步證實[6-8]。

在本研究中顯示，在乳腺癌中P57kip2蛋白的表達顯著低于癌旁正常腺體組織，P57kip2蛋白乳腺癌組織中各臨床分級中及癌旁正常腺體組織中的表達存在負相關，P57kip2蛋白乳腺癌組織中各臨床分期中及癌旁正常腺體組織中的表達亦存在負相關，這些都進一步證實P57kip2的缺失與乳腺癌發(fā)生發(fā)展有密切關系，并且缺失提示預后不良或者是預后不良的危險因素之一，至于為什么在有或無淋巴結轉移中相比較并無明顯差異，可能提示P57kip2只在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展的早期起作用，在進一步浸潤中的作用不明顯，或者到了部分晚期乳腺癌組織中P57kip2開始扮演促進腫瘤浸潤和轉移的作用，當然也有可能還需要更多更大范圍的實驗研究來進一步證實乳腺癌發(fā)生淋巴結轉移后P57kip2的作用。

總之，在本研究中可以看出乳腺癌發(fā)生機制中有涉及細胞周期調節(jié)環(huán)路中的CDC25A、P57kip2基因的異常，而且兩者在整個乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著完全相反的作用，我們從中分析，可以大膽猜測CDC25A的過度表達可能和P57kip2的低表達在乳腺癌發(fā)生中起協同作用。當然進一步得證實還有賴于更多標本的收集及更多實驗的論證。

P57kip2蛋白的功能實現依靠兩種途徑，一是抑制CDK復合物，二是抑制PCNA即細胞核增生抗原[9,10]。本文結果表明CDC25A和P57kip2能夠一起組合成細胞調節(jié)通道，主要是在細胞周期中，這一通道的形成和乳腺癌的發(fā)生以及發(fā)展有重大聯系。

本文中的所有研究中能夠發(fā)現，CDC25A蛋白在所有檢測的組織中都有表達，使癌旁正常腺體和乳腺癌組織進行比較，其在CDC25A的表達方面差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。尤其是在乳腺癌組織中，CDC25A高度表達，乳腺癌的病理分級程度不同表達也不同，腫瘤分化程度越高，CDC25A的表達越低，在Ⅰ級到Ⅲ級表達逐漸降低；CDC25A在乳腺癌組織中的表達比癌旁正常腺體中的表達明顯升高。從試驗結果中可以看出，乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展過程離不開CDC25A蛋白的作用，它可以導致癌細胞增殖，還和腫瘤的病理分化程度有正相關關系，在臨床癌癥疾病的分期中與Ⅰ期、Ⅱ期也成正相關關系，同樣與其有正相關關系的還有淋巴結轉移。如果檢測出CDC25A蛋白表達程度高，則表示預后效果不佳。在癌旁正常腺體的組織中能夠檢測到大量P57kip2蛋白，但是在乳腺癌組織中檢測出的P57kip2蛋白就比較低，在腫瘤的Ⅰ級到Ⅲ的分級中，腫瘤分化程度不斷降低的，P57kip2蛋白的表達也逐漸降低，并且與腫瘤的病理分化程度及臨床分期均呈負相關。提示P57kip2的缺失可能參與了乳腺癌的演變過程。由于CDC25A的過度表達、P57kip2的丟失均是通過共同的Rb途徑參與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。由此我們可以推斷：P57kip2蛋白能夠被當作一種新抑癌基因，細胞惡性增殖可能會導致P57kip2蛋白表達缺失[11-13]。P57kip2蛋白在乳腺癌中呈低水平表達，在癌旁正常腺體中均呈高表達，P57kip2的低表達與乳腺癌的分化程度密切相關，腫瘤從Ⅰ級到Ⅲ級其分化程度逐漸降低，表達也逐漸降低，這和乳腺癌大小，臨床分期也密切相關，腫瘤越大，分期越晚，P57kip2表達就越低。P57kip2在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能還扮演著一個抑癌基因的角色，其表達的缺失可能參與了乳腺癌的演變過程[14,15]。

綜上所述，CDC25A的過度表達和P57kip2的低表達可能在乳腺癌的發(fā)生中起作用；乳腺癌發(fā)生機制中可能有涉及細胞周期調節(jié)環(huán)路中的CDC25A、P57kip2基因的異常；CDC25A及P57kip2可能成為乳腺癌的診斷標記，預后判斷。

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Correlation between expressions of P57kip2and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer

ZHANGWenjing.

DepartmentofClinicalLaboratory,TCMHospitalofCaidianDistrict,Wuhan430100,China

【Abstract】ObjectiveTo investigatre the correlation between expressions of P57kip2 and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer,and to explore the relationship between CDC25A and P57kip2.MethodsThe expression levels of CDC25A and P57kip2protein were detected by Western Blot in 64 cases of breast cancer,then the correlation between expressions of P57kip2and CDC25A protein in breast cancer and pathological grading as well as clinical staging of breast cancer was analyzed.ResultsThe expression of CDC25A protein counld be found in breast cancer cells and normal cells surrounding cancer cells,however,which was high-expressed in breast cancer (P<0.05),in addition to that,the lower differentiation degrees of tumor,the higher expression levels of CDC25A protein (P<0.05).There were significant differences in the expression levels of CDC25A protein among clinical stageⅠ,stage Ⅱ,with lymph node metastasis,without lymph node metastasis (P<0.05).The expression levels of P57kip2protein were decreased,however,which were increased in normal gland tissues beside cancer (P<0.05).ConclusionThe overexpression of CDC25A and low-expression of P57kip2may play an important role in the pathogenesis of breast cancer.The pathogenesis of breast cancer may be related with the gene abnormality of CDC25A,P57kip2,which may become markers in diagnosis and prognosis judgment of breast cancer.

【Key words】breast carcinoma;cell division control 25 phosphatases A; P57kip2 protein;Western Blot

(收稿日期：2015-10-17)

【中圖分類號】R 737.9

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)10-1471-04

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.008

項目來源：湖北省自然科學基金資助項目(編號：2014CDB06802)