劉亮　巨英超　左靜　曲藝　尤殿平

050011　石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細胞室(劉亮、巨英超、左靜)；河北省醫(yī)學(xué)情報研究所(曲藝)；河北省衛(wèi)生醫(yī)學(xué)科技發(fā)展研究中心(尤殿平)

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·論著·

表沒食子兒茶素沒食子酸酯調(diào)控食管癌細胞線粒體膜電位誘導(dǎo)細胞凋亡作用研究

劉亮巨英超左靜曲藝尤殿平

050011石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤研究所流式細胞室(劉亮、巨英超、左靜)；河北省醫(yī)學(xué)情報研究所(曲藝)；河北省衛(wèi)生醫(yī)學(xué)科技發(fā)展研究中心(尤殿平)

【摘要】目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)調(diào)控食管癌細胞Ec9706線粒體膜電位誘導(dǎo)細胞凋亡作用。方法不同濃度(100、200、300 mg/L) EGCG作用Ec9706細胞24 h后，Annexin V/PI雙標(biāo)流式細胞術(shù)方法檢測細胞凋亡水平；流式細胞術(shù)檢測細胞線粒體膜電位；Western Blot 方法檢測細胞中Caspase-3蛋白表達水平，0.9%氯化鈉溶液代替EGCG作為對照組。結(jié)果100、200、300 mg/L EGCG作用Ec9706細胞24 h后，與對照組相比Ec9706細胞凋亡率顯著增高(P<0.01)，300 mg/L EGCG組細胞凋亡率顯著高于100、200 mg/L EGCG組(P<0.01)。EGCG可顯著降低細胞線粒體膜電位(P<0.01)，且具有劑量依賴性。western-blot結(jié)果顯示，EGCG組與對照組相比Caspase-3蛋白表達水平顯著增高(P<0.05)。結(jié)論EGCG具有誘導(dǎo)食管癌Ec9706細胞凋亡作用，其作用機制可能與調(diào)控線粒體膜電位引起內(nèi)源性細胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】表沒食子兒茶素沒食子酸酯；食管癌；細胞凋亡；流式細胞術(shù)

綠茶具有防癌和抗癌的功效，茶多酚是其起功效的主要成分，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是綠茶提取物中主要的酚類化合物。EGCG是從中國綠茶中提取的一種成分，也是綠茶主要的活性和水溶性成分，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%。研究顯示，EGCG具有清除自由基、抗炎、抗氧化、抗紫外線、預(yù)防心血管疾病等功效[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG2還具有抗腫瘤活性[5-8]，引起研究者高度重視，EGCG具有低毒副作用的特點，如果能將其開發(fā)為抗腫瘤藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。食管癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率較高，河北省是食管癌的高發(fā)區(qū)，尤其是邯鄲的磁縣，食管癌發(fā)病和病死率較高，嚴(yán)重威脅了人們的生命健康，多數(shù)就診患者已是中晚期，常規(guī)的手術(shù)及放化療效果不佳，尋找高效低毒的抗食管癌藥物顯得十分重要。本課題探討EGCG是否具有抗食管癌作用，利用食管癌細胞Ec9706，較系統(tǒng)地研究EGCG調(diào)控Ec9706細胞線粒體膜電位誘導(dǎo)細胞凋亡作用機制，為臨床上尋找高效低毒的抗食管癌藥物提供實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑及儀器:EGCG購自美國Sigma公司，AnnexinV-FITC/PI雙染檢測凋亡試劑盒購自美國Beckman Coulter公司，若丹明123(Rhodanmine 123, Rho 123)試劑購自solarbio公司，兔抗人Caspase-3抗體購自北京中杉金橋公司，胎牛血清購自杭州四季青公司。Epics-XL型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司。

1.1.2細胞株:人食管癌Ec9706細胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室惠贈，本實驗室傳代培養(yǎng)。接種細胞于含10%胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基中(補充青霉素、鏈霉素各100 U/L)，培養(yǎng)器皿置于37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.2方法

1.2.1實驗分組及藥物干預(yù)實驗:取對數(shù)生長期的Ec9706細胞1×106接種至細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，加入不同濃度的EGCG，使終濃度分別達到0、100、200、300 mg/L，對照組使用0.9%氯化鈉溶液代替EGCG(0 mg/L EGCG)，作用24 h后，收集細胞，PBS液洗滌2次，300目尼龍網(wǎng)過濾制備成合格的單細胞懸液。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.2流式細胞術(shù)方法檢測細胞凋亡:取上述制備的單細胞懸液1 ml(含1×106細胞)。冷PBS洗滌細胞1次，100 μl冷1×binding buffer 懸浮細胞，加入10 μl Annexin V-FITC，冰上避光放置15 min，加入380 μl 1×binding buffer，加入10 μl PI染液冰上避光放置15 min，冷PBS洗滌細胞1次，1 ml PBS懸浮細胞后，上流式細胞儀檢測。應(yīng)用Expo 32 ADC軟件進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，計算早期細胞凋亡率及晚期細胞凋亡率。

1.2.3流式細胞術(shù)方法檢測細胞線粒體膜電位:取上述制備的單細胞懸液1 ml(含1×106細胞)，冷PBS洗滌細胞1次，100 μl PBS液懸浮細胞，加入Rho 123染料，使最終濃度達到10 μg/ml，在37℃下避光平衡30 min，PBS洗滌細胞1次后，使用流式細胞儀檢測。應(yīng)用Expo 32 ADC軟件進行免疫熒光數(shù)據(jù)分析，以平均熒光強度表示細胞線粒體膜電位水平。

1.2.4western-blot方法檢測細胞中Caspase-3蛋白的表達水平:取上述制備單細胞懸液，冷PBS洗滌細胞1次，離心去上清，使用RIPA試劑常規(guī)方法提取細胞蛋白。取30 μg蛋白與1×上樣緩沖液按1∶4的比例加樣，于8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TTBS液封閉，4℃過夜，TTBS液洗膜后加Caspase-3一抗(1∶200) 進行雜交，再度洗膜后加辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗(1∶2 000)進行雜交，最后洗膜后加入DAB液進行條帶顯色，其中β-actin為內(nèi)參照。對條帶進行掃描，并用Gel-Pro Analyzer 3.1軟件分析條帶的OD，計算Caspase-3條帶OD/β-actin條帶OD，作為Caspase-3的相對含量。實驗重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1EGCG作用Ec9706細胞后細胞凋亡水平流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，不同濃度(100、200、300 mg/L)EGCG作用Ec9706細胞24h后，細胞凋亡率分別為(7.01±0.54)%、(15.12±0.98)%、(21.07±1.27)%，與對照組(0.56±0.08)%相比細胞凋亡率顯著增高(P<0.01)，且具有劑量依賴性。見圖1、2。

圖1　不同濃度EGCG作用Ec9706細胞后細胞凋亡

圖2　4組細胞凋亡率比較

2.2EGCG作用Ec9706細胞后細胞線粒體膜電位水平100、200、300 mg/L EGCG組Ec9706細胞線粒體膜電位水平分別為(347±16)、(286±22)、(164±17) 與對照組 (406±12) 相比顯著降低(P<0.01)，且隨著EGCG濃度增加，細胞內(nèi)線粒體膜電位水平也呈現(xiàn)逐漸降低趨勢，且組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)。見圖3、4。

圖3　不同濃度EGCG作用Ec9706細胞后細胞線粒體膜電位水平

圖4EGCG組與對照組相比，細胞線粒體膜電位水平顯著降低，且具有劑量依賴性

2.3EGCG作用Ec9706細胞后細胞Caspase-3蛋白表達水平100、200、300 mg/L EGCG組Ec9706細胞Caspase-3蛋白表達量分別為(0.40±0.03)、(0.53±0.06)、(0.68±0.05),與對照組(0.28±0.05)相比顯著增高(P<0.01)，且隨著EGCG濃度增加，細胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達量也呈現(xiàn)逐漸增高趨勢，且組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖5、6。

2.4EGCG作用Ec9706細胞后細胞凋亡水平與線粒體膜電位水平相關(guān)性分析EGCG作用Ec9706細胞后細胞凋亡水平與線粒體膜電位水平呈顯著負相關(guān)性(pearson相關(guān)系數(shù)=-0.953，P=0.000)。

3討論

綠茶具有防癌作用，本課題主要探討綠茶中主要提取物EGCG抗食管癌作用及其相關(guān)機制，為臨床上尋找高效、低毒的抗食管癌藥物及為研究EGCG抗癌作用提供實驗基礎(chǔ)。EGCG是茶多酚中最有效的活性成分，屬于兒茶素，EGCG是從中國綠茶中提取的一種成分，是綠茶主要的活性和水溶性成分，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9%～13%。EGCG具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗動脈硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎及抗腫瘤作用，尤其在抗腫瘤作用方面，目前得到了廣泛的研究。大量的研究顯示了EGCG對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用[9-12]或?qū)熕幬锏脑雒糇饔肹13,14]。研究顯示，EGCG抗腫瘤作用機制多圍繞誘導(dǎo)細胞凋亡、引起細胞周期阻滯及誘導(dǎo)細胞自噬等方面[15-17]，而且研究顯示，EGCG對腫瘤干細胞也具有生長抑制作用[18]。EGCG來源于綠茶，是綠茶的提取物，具有低毒副作用的特點，如果能將其開發(fā)為光譜的抗腫瘤藥物，將會具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖5　不同濃度EGCG作用Ec9706細胞后細胞中Caspase-3蛋白表達

圖6　4組Caspase-3蛋白表達量比較

食管癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，發(fā)病及病死率較高，我國食管癌高發(fā)，尤其是河北的磁縣及河南的林州食管癌發(fā)病及病死率較高，威脅了人們的生活健康。目前食管癌的常規(guī)治療包括手術(shù)、化療及放療，對于晚期或不能手術(shù)者，往往選擇放療及化療，目前由于化療藥物的高毒副作用及耐藥的產(chǎn)生嚴(yán)重影響了其治療效果，最終導(dǎo)致化療失敗。尋找高效低毒的抗食管癌藥物顯得格外重要。綠茶是人們常用飲品，具有安全無毒的特點，如能將其提取物EGCG用于抗癌藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。目前研究顯示，EGCG對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用[19,20]，但在食管癌中的研究較少，且缺乏系統(tǒng)的機制研究，本課題通過觀察EGCG是否對Ec9706細胞線粒體膜電位有影響，研究其是否能夠通過線粒體膜電位的內(nèi)源性凋亡通路引起食管癌細胞凋亡，為臨床上食管癌治療提高高效、低毒的抗食管癌藥物提供實驗基礎(chǔ)。

細胞增殖及細胞凋亡間的平衡維持著正常細胞生長，細胞凋亡的異常往往會引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化，因此，誘導(dǎo)細胞凋亡是目前新藥物研發(fā)評價藥物療效的主要指標(biāo)。細胞凋亡途徑包括，外部途徑，通過胞外信號激活細胞內(nèi)的凋亡酶caspase；另一條通路是內(nèi)部途徑，通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。內(nèi)源性凋亡途徑是目前研究藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡常用的途徑[21]。在本實驗中首先觀察到了EGCG對食管癌Ec9706細胞具有誘導(dǎo)細胞凋亡和直接殺傷作用，這些結(jié)果通過流式細胞術(shù)的AnnexinV-PI雙染方法進行，可以同時檢測到了細胞凋亡及壞死的細胞比例，且EGCG對食管癌Ec9706細胞誘導(dǎo)凋亡作用具有劑量依賴性，隨著EGCG濃度的增加，EGCG誘導(dǎo)Ec9706細胞凋亡率也隨之增加，這樣奠定了EGCG具有抗食管癌作用基礎(chǔ)，接下來進一步研究EGCG對食管癌Ec9706細胞誘導(dǎo)凋亡的作用機制。通過研究細胞內(nèi)線粒體膜電位的實驗結(jié)果，提示，EGCG可以降低細胞內(nèi)線粒體膜電位，線粒體膜電位的減低可以使誘導(dǎo)細胞凋亡的因子(如細胞色素C等)釋放從而激活Caspase-3等蛋白，引起細胞凋亡，且EGCG降低細胞內(nèi)線粒體膜電位水平具有EGCG濃度依賴性，隨著EGCG濃度的增加，EGCG降低Ec9706細胞內(nèi)線粒體膜電位水平也隨之增加。同時實驗中也發(fā)現(xiàn)，EGCG組Ec9706細胞中Caspase-3蛋白表達水平顯著增高，且具有EGCG的濃度依賴性。這些結(jié)果與線粒體凋亡的內(nèi)源性凋亡途徑因子變化趨勢一致。

綜合上述的研究結(jié)果，提示，EGCG可以誘導(dǎo)Ec9706細胞凋亡及直接殺傷細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡的機制與降低線粒體膜電位及升高Caspase-3蛋白表達水平有關(guān)。EGCG具有低毒、價廉的特點，如果能將其開發(fā)為抗食管癌藥物，將具有廣泛的應(yīng)用前景。

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Epigallocatechin-3-gallate induced Ec9706 cell apoptosis by regulating the mitochondrial transmembrane potential

LIULiang,JUYingchao,ZUOJing,etal.

DepartmentofFCM,ResearchinstituteofOncology,TheFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of and action mechanism of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in inducing cell apoptosis of esophageal cancer (Ec9706 cell) through regulating mitochondrial transmembrane potential.MethodsThe Ec9706 cells were treated by different doses of EGCG (100,200,300mg/L) for 24h,then the cell apoptosis rates were detected by AnnexinV/PI staining. The mitochondrial transmembrane potential was measured by flow cytometry.Moreover the expression levels of Caspase-3 protein were detected by Western Blot. Normal saline instead of EGCG was used as control group.ResultsAfter Ec9706 cells were treated by different doses of EGCG (100,200,300mg/L) for 24h,the cell apoptosis rates in EGCG groups were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05), moreover, which in 300mg/L EGCG group were significantly higher than those in 100mg/L and 200mg/L EGCG group (P<0.01). EGCG could obviously decrease mitochondrial transmembrane potential (P<0.01),with a dose-dependent manner. The results by Western Blot showed that the expression levels of Caspase-3 protein in EGCG groups were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05).ConclusionEGCG has the effects of inducing Ec9706 cell apoptosis,and its action mechanism may be correlated to regulating mitochondrial transmembrane potential to induce endogenous cell apoptosis.

【Key words】epigallocatechin-3-gallate; esophageal cancer; cell apoptosis; flow cytometry

(收稿日期：2015-10-20)

【中圖分類號】R 735.1

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002-7386(2016)10-1457-04

通訊作者：尤殿平，050000河北省衛(wèi)生醫(yī)學(xué)科技發(fā)展研究中心；

doi:10.3969/j.iss n.1002-7386.2016.10.004

項目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點課題(編號：20150345;20160167)；河北省普通高等學(xué)校強勢特色學(xué)科腫瘤學(xué)建設(shè)經(jīng)費[冀教高(2005)52號]

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