侯小梅， 魏晶晶， 陳志瓊

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016；2.重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所，重慶402160；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

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補(bǔ)腎益智方對(duì)老年癡呆癥大鼠腦內(nèi)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

侯小梅1，2， 魏晶晶3， 陳志瓊1*

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016；2.重慶市永川食品藥品檢驗(yàn)所，重慶402160；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

摘要：目的 研究補(bǔ)腎益智方對(duì)老年癡呆癥大鼠腦內(nèi)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響。方法 采用微透析技術(shù)收集透析樣品，HPLC-FLU方法檢測(cè)老年癡呆癥大鼠腦內(nèi)天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）和γ-氨基丁酸（γ-GABA）4種氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含有量。結(jié)果 補(bǔ)腎益智方能明顯降低老年癡呆癥大鼠腦內(nèi)興奮性氨基酸Asp和Glu的含有量，升高抑制性氨基酸Gly和γ-GABA的含有量。結(jié)論 補(bǔ)腎益智方能降低興奮性氨基酸含有量，為其防預(yù)及緩解老年癡呆癥狀提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)腎益智方；老年癡呆癥；氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)；微透析系統(tǒng)；HPLC-FLU

近年來(lái)，老年癡呆癥發(fā)病率大大增加，已成為嚴(yán)重威脅老年人健康的疾病之一。老年癡呆主要包括阿爾茨海默?。ˋlzheimer，s disease，AD）和血管性癡呆（vascular dementia，VD）。AD又名早老性癡呆，是一種多源性因素引起的原發(fā)性大腦神經(jīng)退行性病變，多伴有乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）活性降低、氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含有量改變，AD患者血漿中興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)有顯著增加，這主要是由于興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)毒性損害機(jī)制，即過(guò)量的興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［1-5］。目前，仍缺乏有效的防治藥物和方法，文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)腎益智方對(duì)D-半乳糖加上鵝膏蕈氨酸（ibotenicacid，IBO）損毀腦Meynert基底核（nucleus basalis of Meynert，NBM）的老年性癡呆模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有一定的保護(hù)作用［6-7］。本研究在采用D-半乳糖致亞急性衰老作用［6-7］形成腦老化的基礎(chǔ)上，再以IBO損毀NBM［8］建立AD大鼠模型，研究補(bǔ)腎益智方對(duì)該AD模型大鼠腦內(nèi)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響，探討補(bǔ)腎益智方的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠50只，雄性，體質(zhì)量330～350 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)SCXK（渝）2014-0025。

1.2 藥品與試劑 補(bǔ)腎益智方，由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參、制首烏提取濃縮，制成1.2 kg/L濃縮液（廣東省中醫(yī)院制劑室，批號(hào)20140201）。石杉?jí)A甲片（上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號(hào)130704，規(guī)格50 μg）。天門(mén)冬氨酸（aspartic acid，Asp）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、甘氨酸（glycine，Gly）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid， γ-GABA）、2-巰基乙醇（2-mercaptoethanol，2-MCE）和鵝膏蕈氨酸（ibotenicacid，IBO）均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為53931420、43907190、089K07117、026K07361、112K0119和066K3775；鄰苯二甲醛（OPA）購(gòu)于廣州威佳科技有限公司，批號(hào)04121209。乙腈為色譜純（美國(guó)Tedia公司）；水為超純水；其余試劑為分析純。

1.3 儀器 腦立體定位儀（瑞沃德生命科技有限公司）；微透析系統(tǒng)（瑞典CMA公司）；XP205（瑞士梅特勒公司）；DIONEX P680液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；酸度計(jì)（瑞士梅特勒公司）；Mill-Q超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 SD雄性大鼠50只，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組注射生理鹽水，模型對(duì)照組腹腔注射D-半乳糖［（48 mg/（kg·d）］6周，第7周10％水合氯醛麻醉（3.5 mL/kg，腹腔注射）大鼠后，頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，于頂骨兩側(cè)冠狀縫后鉆出小孔。位坐標(biāo)為前鹵后0.9 mm，中線(xiàn)外側(cè)2.6 mm，深7.5 mm，每側(cè)用微量注射器分別注人藥液1 μL（含IBO 5 μg/L），速率0.2 L/min，留針5 min，并另開(kāi)小孔，將微透析探針套管植入海馬區(qū)（前囟后1.6 mm，中線(xiàn)左側(cè)1.2 mm，深度6.5 mm）［9-10］，并利用給藥小孔用小螺絲和牙托粉將管套固定，手術(shù)后縫合皮膚，48 h內(nèi)肌注青霉素抗感染，補(bǔ)腎益智方高、中、低劑量組造模均與模型組相同，在手術(shù)完48 h后灌胃給予補(bǔ)腎益智方6、3、1.5 g/（kg·d），連續(xù)灌胃5周，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組則以等量生理鹽水灌胃。

1.4.2 透析液的收集 給藥第1天以0計(jì)數(shù)，每隔5 d將探針與微型注射泵相連，微透析系統(tǒng)灌流，以2 μL/min速率開(kāi)始灌流人工腦脊液（145 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，pH=7.4），30 min時(shí)收集透析液，OPA柱前衍生化后，HPLC-FLU測(cè)定Asp、Gly、Glu和γ-GABA含有量。

1.4.3 衍生試劑的配制及衍生化反應(yīng) OPA衍生化試劑的配方為20 mg OPA+50 μL 2-MCE +5 mL甲醇+9 mL硼酸緩沖液（0.4 mol/L，pH=9.6）。柱前衍生化反應(yīng)為20 μL樣品（對(duì)照品）+25 μL OPA衍生試劑，渦旋混勻15 s，靜止反應(yīng)1 min，進(jìn)樣20 μL（所有操作均避光）［11-13］。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)貯備液 精密稱(chēng)取Asp、Glu、Gly和γ-GABA適量置同一500 mL量瓶中，加人工腦脊液至刻度，超聲使其溶解即得到濃度均為40 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.4.5 液相色譜條件 Synergi Hydro-RP C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）、C18保護(hù)柱（4 mm×2 mm，4 μm）均購(gòu)于美國(guó)菲羅門(mén)公司；流動(dòng)相A為乙酸鈉緩沖液（10 mmol/L，冰醋酸調(diào)節(jié)pH為5.3），B為乙腈，梯度洗脫（0～3 min，15％B；3～15 min，15％～55％B；15～18 min，55％～15％B；18～23 min，15％B）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30℃；熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)（λex）及發(fā)射波長(zhǎng)（λem）分別為340 nm和455 nm。

1.4.6 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 13.0軟件分析，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，p<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取大鼠空白腦脊液、標(biāo)準(zhǔn)貯備液及樣品溶液，按“1.4.3”項(xiàng)下方法處理后在“1.4.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。由圖1可知，Asp、Glu、Gly和γ-GABA保留時(shí)間分別為3.61、4.68、10.97、13.42 min，峰形對(duì)稱(chēng)良好，樣品中其他雜質(zhì)峰不干擾測(cè)定，專(zhuān)屬性理想。

1.Asp 2.Glu 3.Gly 4.GABA圖1　HPLC色譜圖

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)制備 精密吸取“1.4.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，依次配成濃度為0.5、1、2、5、10、20、40 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，按“1.4.3”項(xiàng)進(jìn)行處理后在“1.4.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），Asp、Glu、Gly和γ-GABA濃度為橫坐標(biāo)（X）擬合回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10 μmol/L），按“1.4.3”方法處理和“1.4.5”條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，得到Asp、Glu、Gly和γ-GABA峰面積RSD分別為1.2％、2.7％、1.9％、2.5％，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一標(biāo)準(zhǔn)品溶液（10 μmol/L），按“1.4.3”方法處理和“1.4.5”條件測(cè)定，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，得到Asp、Glu、Gly和γ-GABA峰面積RSD分別為2.1％，1.9％，1.6％和2.8％，表明溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 回收率試驗(yàn) 取含有量已知（Asp、Glu、Gly、γ-GABA）的樣品溶液3份（各20 μL），分別加入含Asp、Glu、Gly和γ-GABA均為10 μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液5、20、80 μL，配成低、中、高（2、5、8 μmol/L）3個(gè)濃度，按“1.4.3”條件處理和“1.4.5”條件測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次。結(jié)果顯示，樣品的加標(biāo)回收率在92.6％～103.7％之間，RSD在1.2％～3.9％之間，符合定量測(cè)定的要求。

2.2 藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 補(bǔ)腎益智方對(duì)興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Asp及Glu含有量的影響 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組Asp及Glu明顯降低（p<0.05）；與模型對(duì)照組相比，補(bǔ)腎益智方組Asp及Glu隨著給藥時(shí)間的增加呈降低趨勢(shì)；隨補(bǔ)腎益智方給藥劑量加大，時(shí)間持續(xù)，Asp和Glu水平顯著低于模型對(duì)照組（p<0.05）。見(jiàn)表2～3。

表2　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠天冬氨酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

表2　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠天冬氨酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05；與空白對(duì)照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對(duì)照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］Asp/（μmol·L-1）-　 4.48±0.23　 4.50±0.17　 4.39±0.05　 4.51±0.18　 4.42±0.23　 4.47±0.20　 4.42±0.11模型對(duì)照組　-　 4.19±0.15※4.12±0.17※4.09±0.14※4.03±0.21※4.01±0.17※3.92±0.22※3.89±0.20※補(bǔ)腎益智方低劑量組　1.5　 4.11±0.08　 4.05±0.19　 3.96±0.22　 3.89±0.09　 3.78±0.08　 3.71±0.24*3.69±0.25*補(bǔ)腎益智方中劑量組　3　4.17±0.17 3.99±0.16 3.85±0.24 3.72±0.13*3.50±0.20*3.47±0.17*3.39±0.06*補(bǔ)腎益智方高劑量組　6　4.19±0.11 3.97±0.24 3.77±0.25*3.65±0.18*3.41±0.12*3.31±0.20*3.19±0.14*

表3　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

表3　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05；與空白對(duì)照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對(duì)照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］Glu/（μmol·L-1）-　 4.98±0.21　 4.93±0.18　 4.89±0.13　 4.91±0.17　 4.89±0.09　 5.05±0.23　 4.99±0.09模型對(duì)照組　-　 4.67±0.10※4.55±0.17※4.56±0.15※4.61±0.14※4.62±0.17※4.69±0.14※4.66±0.13※補(bǔ)腎益智方低劑量組　1.5　 4.69±0.12　 4.55±0.24　 4.49±0.08　 4.46±0.21　 4.37±0.15*4.31±0.20*4.24±0.12*補(bǔ)腎益智方中劑量組　3　4.52±0.22 4.38±0.16 4.32±0.19*4.25±0.24*4.07±0.28*3.98±0.15*3.91±0.16*補(bǔ)腎益智方高劑量組　6　4.59±0.14 4.31±0.21*4.18±0.13*4.09±0.26*3.85±0.23*3.77±0.17*3.72±0.14*

2.2.2 補(bǔ)腎益智方對(duì)抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Gly和γ-GABA含有量的影響 與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組Gly及γ-GABA均明顯降低（p<0.05）；與模型對(duì)照組相比，補(bǔ)腎益智方組Gly及γ-GABA隨著給藥時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)；隨補(bǔ)腎益智方給藥劑量加大，時(shí)間持續(xù)，Gly和γ-GABA水平顯著高于模型對(duì)照組（p<0.05）。見(jiàn)表4～5。

表4　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠甘氨酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

表4　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠甘氨酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05；與空白對(duì)照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對(duì)照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］Gly/（μmol·L-1）-　 5.39±0.09　 5.41±0.14　 5.38±0.27　 5.37±0.20　 5.39±0.14　 5.35±0.33　 5.40±0.27模型對(duì)照組　-　 4.35±0.11※4.38±0.17※4.44±0.23※4.51±0.25※4.52±0.10※4.48±0.25※4.47±0.30※補(bǔ)腎益智方低劑量組　1.5　 4.42±0.14　 4.53±0.15　 4.55±0.31　 4.57±0.29　 4.63±0.18　 4.61±0.21　 4.65±0.11補(bǔ)腎益智方中劑量組　3　4.38±0.07　 4.54±0.24　 4.59±0.27　 4.71±0.17　 4.77±0.08*4.85±0.27*4.89±0.21*補(bǔ)腎益智方高劑量組　6　4.44±0.17 4.57±0.22 4.79±0.21*4.91±0.13*5.03±0.25*5.12±0.23*5.24±0.19*

表5　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠γ-氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

表5　補(bǔ)腎益智方對(duì)大鼠γ-氨基丁酸神經(jīng)遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=10）

注：與模型對(duì)照組比較，*p<0.05；與空白對(duì)照組比較，※p<0.05

0 d　5 d　10 d　15 d　20 d　25 d　30 d空白對(duì)照組組別　　劑量/ ［g·（kg·d）-1］γ-GABA/（μmol·L-1）-　 6.36±0.13　 6.27±0.17　 6.41±0.25　 6.39±0.27　 6.45±0.23　 6.37±0.17　 6.39±0.25模型對(duì)照組　-　 5.34±0.19※5.41±0.25※5.48±0.17※5.50±0.29※5.51±0.27※5.53±0.23※5.54±0.19※補(bǔ)腎益智方低劑量組　1.5　 5.36±0.24　 5.43±0.11　 5.52±0.33　 5.57±0.30　 5.63±0.21　 5.69±0.25　 5.71±0.35補(bǔ)腎益智方中劑量組　3　5.33±0.28　 5.39±0.20　 5.53±0.20　 5.61±0.28　 5.68±0.22　 5.75±0.19　 5.86±0.31*補(bǔ)腎益智方高劑量組　6　5.38±0.23　 5.51±0.18　 5.58±0.29　 5.67±0.26　 5.85±0.26*5.97±0.30*6.08±0.14*

3 討論

缺乏有效的防治手段是當(dāng)前AD研究中需要解決的主要問(wèn)題之一。目前在臨床上已經(jīng)使用的AD治療藥物主要有膽堿酯酶抑制劑、鈣通道阻滯劑和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑等，但療效均不理想［3-4］。發(fā)揮中醫(yī)用藥特色，尋找有效治療AD的中藥具有十分重要的意義。國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)提示補(bǔ)腎、調(diào)心等方藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力有一定的改善作用［6，14-15］。中醫(yī)認(rèn)為AD等老年癡呆癥的主要病機(jī)為腎虛髓虧、腦脈失養(yǎng)。補(bǔ)腎益智方由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參、制首烏中藥組成，是針對(duì)AD腎精不足、氣血虧虛的病機(jī)而設(shè)計(jì)的組方；全方具補(bǔ)腎填精、益氣養(yǎng)血、開(kāi)竅醒神等功效，臨床試用于A(yíng)D病人已顯示了一定的療效［16］，且實(shí)驗(yàn)室前期水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)腎益智方能顯著提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力［6，14，17］。

Asp、Glu、Gly和γ-GABA是神經(jīng)藥理中常涉及到的4種最重要的氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，其中，Asp、Glu是興奮性氨基酸，Gly和γ-GABA是抑制性氨基酸。近幾年，有關(guān)興奮性氨基酸和抑制性氨基酸與AD發(fā)病及學(xué)習(xí)記憶的密切關(guān)系已引起重視，一般認(rèn)為興奮性氨基酸具有神經(jīng)毒性，興奮性氨基酸的大量釋放可致神經(jīng)細(xì)胞損傷，其機(jī)制與Ca2 +超載有關(guān)［3，18］，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)具有突觸后抑制作用，可通過(guò)減少Ca2 +內(nèi)流而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益智方能顯著降低實(shí)驗(yàn)性AD大鼠腦積液中興奮性氨基酸Asp和Glu的含有量，升高抑制性氨基酸Gly和γ-GA-BA的含有量，這可能與其防治AD的機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)模型組動(dòng)物腦積液中4種氨基酸含有量都明顯低于空白對(duì)照組，這可能是由于造模過(guò)程加速了動(dòng)物的衰老和進(jìn)一步的神經(jīng)元損傷及退行性病變，而補(bǔ)腎益智方能阻止這種由造模引起的氨基酸含有量的改變，同時(shí)提示補(bǔ)腎益智方有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

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*通信作者：陳志瓊（1969—），女，副教授，從事藥物質(zhì)量控制及有效性評(píng)價(jià)研究。E-mail：chenzhiqiongcq@163.com

作者簡(jiǎn)介：侯小梅（1985—），女，碩士，從事中藥安全性及有效性評(píng)價(jià)研究。Tel：18182229518，E-mail：379426452@qq.com

收稿日期：2015-02-11

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.041

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）05-1151-04