李寶玲， 段婧婧， 岳永花， 張軼歐

（山西省中醫(yī)院，山西太原030012）

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疏腦解郁湯對卒中后抑郁大鼠學習記憶能力的影響及作用機理研究

李寶玲， 段婧婧， 岳永花， 張軼歐

（山西省中醫(yī)院，山西太原030012）

摘要：目的 研究疏腦解郁湯（柴胡、黃芩、半夏等）對卒中后抑郁大鼠學習記憶能力的影響及其作用機理。方法采用Zea-longa改良線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型，結(jié)合孤養(yǎng)及慢性不可預知溫和刺激復合制備卒中后抑郁模型，將造模成功的卒中后抑郁大鼠隨機分為模型組，疏腦解郁湯大、中、小劑量組及帕羅西汀組5組，每組15只，另加空白對照組15只。疏腦解郁湯大、中、小劑量組給予疏腦解郁湯水溶液（3.015、1.058、0.704 g/kg）灌胃，帕羅西汀組予鹽酸帕羅西汀水溶液（0.001 7g/kg）灌胃，空白對照組、模型組予等體積生理鹽水灌胃。灌胃第4周，觀察大鼠學習記憶能力，給藥結(jié)束后，將各組大鼠斷頭取腦進行腦組織病理學觀察，并檢測海馬組織內(nèi)單胺遞質(zhì)的含有量。結(jié)果 疏腦解郁湯大劑量能顯著降低大鼠定位航行逃避潛伏期時間及空間搜索時間（p<0.05或p<0.01），并能提高腦組織中5-羥色胺（5-HT）、多巴胺（DA）、去甲腎上腺素（NE）的含有量（p<0.05或p<0.01）。病理結(jié)果顯示疏腦解郁湯各劑量組能改善模型大鼠的海馬組織病理損傷。結(jié)論 疏腦解郁湯大劑量組能有效提高卒中后抑郁大鼠學習記憶能力，改善卒中后抑郁大鼠的抑郁癥狀，對卒中后抑郁大鼠海馬組織損傷具有保護作用，其機制可能與升高腦卒中后抑郁（PSD）大鼠海馬組織內(nèi)單胺遞質(zhì)含有量有關。

關鍵詞：疏腦解郁湯；卒中后抑郁；水迷宮；學習記憶能力；單胺遞質(zhì)

腦卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）是指腦卒中后出現(xiàn)的以持續(xù)性的抑郁癥狀為主要臨床表現(xiàn)的心理障礙，并且癥狀維持2周以上者。腦卒中也成為老年人群致殘率和病死率最高的三大疾病之一［1］，腦卒中后常常會伴隨著PSD并發(fā)癥的發(fā)生，PSD的主要臨床表現(xiàn)包括腦卒中后出現(xiàn)的易疲勞、思維遲緩、情緒低落、悲觀絕望，甚至有輕生念頭等不正常行為。PSD嚴重影響著患者腦卒中后的功能康復以及生活質(zhì)量，也給家庭和社會增加了沉重的負擔［2］。目前，其病因和發(fā)病機制還未明確，因而治療手段以及治療效果都不太理想。疏腦解郁湯是本人在多年治療卒中后抑郁的臨床經(jīng)驗基礎上，以氣郁血瘀痰阻為本病的重要病機而擬定的以疏肝解郁、理氣活血、化痰寧心為主要治療法則的經(jīng)驗方。本研究通過觀察疏腦解郁湯對PSD大鼠的學習記憶能力的影響及腦組織病理學觀察，并檢測海馬組織內(nèi)5-HT、NE、DA的含有量，探討疏腦解郁湯對PSD的預防及治療作用，并進一步探討其可能的作用機制。

1 材料

1.1 動物 150只雄性SD大鼠，體質(zhì)量為180～200 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，合格證號SCXK-（軍）2012-0004，清潔級。于恒溫環(huán)境中進行適應性飼養(yǎng)，保持環(huán)境清潔，飲水進食不限，持續(xù)1周。

1.2 藥品、試劑 疏腦解郁湯（柴胡10 g、黃芩10 g、半夏10 g、炙甘草6 g、陳皮10 g、茯苓10 g、枳實10 g、竹茹10 g、石菖蒲10 g、遠志20 g、炒棗仁30 g、丹參30 g、赤芍20 g、合歡皮20 g、川芎10 g）由山西省中醫(yī)藥研究院藥房提供（去除雜質(zhì)，純凈藥材。加水浸泡，煎煮藥材2次，每次約1 h，趁熱過濾。將濾液合并，并進一步濃縮至膏狀。將濃縮膏熱烘至干燥，研成粉末，備用）。鹽酸帕羅西汀片（賽樂特）（中美天津史克制藥有限公司，國藥準字H10950043）；5-HT試劑盒（Bio-Swamp Life Science Lab批號：201406）；NE試劑盒（Bio-Swamp Life Science Lab，批號201406）；DA試劑盒（Bio-Swamp Life Science Lab，批號201406）。

1.3 儀器 Finnpipette微量移液器（賽默飛世爾［上海］有限公司）；AT-858型自動酶標分析儀（上海安泰分析儀器有限公司）；KDC-2046低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司）；BS223S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DZKW-4恒溫水浴箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

2 方法

2.1 PSD動物模型制備 本實驗中，PSD大鼠模型是先根據(jù)線栓法來制作成大腦中動脈閉塞模型，再結(jié)合孤養(yǎng)法以及慢性的不可預知的溫和刺激，最終復合制作而成。實驗前予大鼠禁食12 h，禁水6 h處理。首先，根據(jù)Zea-longa改良線栓法［3］來制作局灶性腦缺血后再灌注大鼠模型，大鼠予以0.4％戊巴比妥（1 mL/100 g）通過腹腔給藥進行麻醉，麻醉后將大鼠仰臥固定在手術臺上，使用常規(guī)的消毒方法后，在頸部正中做一縱形切口，分離頸部組織使左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）以及頸外動脈（ECA）充分暴露。使用無創(chuàng)微血管夾將CCA、ICA夾閉，結(jié)扎ECA，從頸總動脈將魚線栓子插入，插入后將微血管夾松開，魚線栓子推經(jīng)CCA最終進入ICA，從CCA分叉處開始計算線栓推進的深度，一般為（1.8±0.5）cm，即可到達大腦中動脈的起始部，從而制作成局灶性腦缺血的狀態(tài)。從線栓進入1.8 cm時作為開始時間，計錄腦缺血的時間，缺血共90 min以后將線栓緩慢拔出，實現(xiàn)再灌注。最后將頸外動脈的殘端進行結(jié)扎，縫合切口。手術期間要用白熾燈照射，將大鼠肛溫維持在（37±0.5）℃之間。待大鼠蘇醒后，按照Zea-longa［3］的V級評分法對術后大鼠進行神經(jīng)功能評分，評分為Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級的大鼠保留備用，常規(guī)條件下進行飼養(yǎng)。術后1周［4］對其進行孤養(yǎng)，并結(jié)合夾尾1 min、禁水24 h、禁食24 h、45℃環(huán)境5 min、晝夜顛倒24 h、水平振蕩30 min（160次/min）、4℃冰水游泳5 min等方法刺激，每天隨機采取這7種刺激方法中的一種，共維持3周時間。應激結(jié)束后，大鼠出現(xiàn)強迫游泳不動時間延長，糖水消耗量明顯減低，體質(zhì)量增長減慢或明顯下降，求生欲望下降等表現(xiàn)，則表示抑郁模型制作成功。本實驗在治療過程中，模型組以及疏腦解郁湯小劑量組大鼠各有1只死亡。

2.2 分組、給藥 實驗共分為6組，分別為空白對照組，模型組，疏腦解郁湯大、中、小劑量組，陽性對照組。

給藥劑量分別按成人給藥劑量的15、7.5、3.8倍來確定疏腦解郁湯大、中、小劑量，即分別為3.015、1.508、0.704 g/kg。鹽酸帕羅西汀給藥劑量為成人給藥劑量的5倍，即1.7 mg/kg。

空白對照組、模型組及假手術組均為單純生理鹽水灌胃，疏腦解郁湯大、中、小劑量組分別予相應溶液灌胃，陽性對照組予鹽酸帕羅西汀溶液灌胃。造模后第3天開始經(jīng)口灌胃給藥，每日1次，動物每周稱重1次，并調(diào)整給藥劑量，連續(xù)給藥4周。

2.3 指標檢測

2.3.1 標本制備 末次給藥后，將所有大鼠進行0.4％戊巴比妥（0.04 g/kg）腹腔給藥麻醉，麻醉后迅速將心臟暴露，從心尖處采集血液，離心（3 000 r/min，15 min）后分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。每組大鼠隨機抽取8只進行斷頭取腦，迅速將海馬組織分離剝出，稱重后，立即放置于水浴勻漿器（4℃）中進行勻漿，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆茫拷M剩余的大鼠都迅速斷頭取腦，分離出海馬組織后置于灌注液容器中備用，以便進一步做病理學觀察。

2.3.2 學習記憶能力實驗 連續(xù)給藥的第4周開始，分別對6組大鼠進行Morris水迷宮測試實驗。該實驗共分兩部分，即定向航行實驗，空間搜索實驗。檢測前，先將大鼠放置于沒有安全島的水池中進行適應性游泳2 min，使其慢慢適應水環(huán)境。檢測時，將安全島放置于水池中，利用圖像分析系統(tǒng)對游泳軌跡及時間進行記錄，每次實驗時安全島應該固定在同一個位置。定向航行實驗被用來測驗大鼠尋找到安全島所用的時間即逃避潛伏期，以及尋找過程的路徑長度即搜索距離，實驗共維持5 d，每天1次?？臻g搜索實驗為將安全島撤走后記錄120 s內(nèi)大鼠在原來放置安全島所在象限的游動時間（探索時間），以及大鼠在該象限的游泳距離占總游泳距離的比值（探索距離比），該實驗在給藥第4周末一天進行。大鼠定向航行實驗以及空間探索實驗結(jié)果可以反映出大鼠空間辨別能力以及學習記憶能力，觀察治療后大鼠的學習記憶能力變化情況。

2.3.3 海馬部位單胺遞質(zhì)含有量的檢測 采用ELISA法，按試劑盒說明進行操作。

2.3.4 腦組織病理學觀察 采用HE染色法，進行腦組織病理學觀察

2.4 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析處理。p<0.05有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 對PSD模型大鼠學習記憶的影響 由表1～2可見，模型組大鼠學習記憶能力較空白對照組顯著降低（p< 0.05或p<0.01）；與模型組比較，舒腦解郁湯大、中劑量組均可不同程度提高PSD大鼠學習記憶能力，以大劑量組提高程度更顯著（p<0.05或p<0.01）。鹽酸帕羅西汀可顯著提高PSD大鼠學習記憶能力（p<0.05或p< 0.01）。

表1　給藥后各組大鼠定位航行逃避潛伏期比較（±s）

表1　給藥后各組大鼠定位航行逃避潛伏期比較（±s）

注：與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，▲p<0.05，▲▲p<0.01

1 d　2 d　3 d　4 d　5 d空白對照組　15　　—組別　　動物數(shù)/只劑量/ （g·kg-1）定位航行逃避潛伏期/s 78.86±12.71　 70.89±10.67　 57.76±13.25　 33.21±10.52　 27.37±9.82模型組　14　　—　112.12±14.53*　107.64±13.10**　93.37±10.52**　68.05±9.29*　43.93±13.19**疏腦解郁湯大劑量組　15　 3.015　 92.9±8.76▲　87.17±12.56▲　73.05±8.62▲　47.03±12.73▲▲　33.24±10.67▲▲疏腦解郁湯中劑量組　15　 1.508　 98.87±14.08　 99.32±12.27▲　84.72±12.55▲　59.32±11.04▲　40.15±10.70疏腦解郁湯小劑量組　14　 0.704 102.60±10.67　 97.37±16.41　 84.99±10.37▲　70.50±12.25　 44.18±13.32陽性對照組　15　 0.001 7 91.02±13.11▲　80.58±9.77▲　66.54±11.28▲▲　43.93±17.04▲▲　32.24±11.79▲▲

表2　各組大鼠空間搜索比較（±s）

表2　各組大鼠空間搜索比較（±s）

注：與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，▲p<0.05，▲▲p<0.01

組別　　動物數(shù)/只　　劑量/（g·kg-1）　　目標象限停留時間/s　　經(jīng)過平臺次數(shù)/次空白對照組　15　　—38.92±1.56　2.98±1.03模型組　14　　—　30.09±2.33**　1.20±0.95*疏腦解郁湯大劑量組　15　3.015　34.30±1.41▲▲　2.20±1.12▲▲疏腦解郁湯中劑量組　15　1.508　31.79±2.15▲　2.03±1.05疏腦解郁湯小劑量組　14　0.704　30.85±1.27　1.77±1.01陽性對照組　15　0.001 7　34.49±1.07▲▲　2.18±0.86▲▲

3.2 疏腦解郁湯對PSD模型大鼠腦組織單胺遞質(zhì)含有量的影響 由表3可見，與空白對照組比較，模型組大鼠腦組織中5-HT、NE、DA含有量顯著降低（p<0.05或p< 0.01）。與模型組比較，疏腦解郁湯大劑量組能顯著提高PSD大鼠腦組織中5-HT、NE、DA含有量（p<0.05或p< 0.01），疏腦解郁湯中、小劑量組能一定程度提高PSD大鼠5-HT含有量，有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；疏腦解郁湯中、小劑量組能一定程度提高PSD大鼠海馬組織內(nèi)NE的含有量，但無統(tǒng)計學意義（p>0.05）；疏腦解郁湯中劑量組能提高PSD大鼠海馬組織中DA的含有量，有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；小劑量組PSD大鼠海馬組織中DA含有量也有所增加，但無統(tǒng)計學意義（p>0.05）；鹽酸帕羅西汀組能顯著提高5-HT含有量，與疏腦解郁湯大劑量組含有量接近，與模型組比較有統(tǒng)計學意義（p<0.01）；鹽酸帕羅西汀組大鼠海馬組織中NE、DA含有量增加不明顯，無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。

表3　疏腦解郁湯對卒中后抑郁模型大鼠腦組織中單胺遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=8）

表3　疏腦解郁湯對卒中后抑郁模型大鼠腦組織中單胺遞質(zhì)含有量的影響（±s，n=8）

注：與空白對照組比較，*p<0.05，**p<0.01；與模型組比較，▲p<0.05，▲▲p<0.01

組別　　劑量/（g·kg-1）　5-HT/（μg·g-1）　NE/（μg·g-1）　DA/（μg·g-1）空白對照組　　—0.566±0.083　0.338±0.039　0.829±0.072模型組　　—　0.371±0.077**　0.193±0.056*　0.494±0.082**疏腦解郁湯大劑量組　3.015　0.455±0.082▲▲　0.271±0.047▲　0.692±0.103▲疏腦解郁湯中劑量組　1.508　0.416±0.088▲　0.230±0.031　0.675±0.113▲疏腦解郁湯小劑量組　0.704　0.393±0.076▲　0.211±0.035　0.644±0.084陽性對照組　0.001 7　0.467±0.078▲▲0.226±0.036　0.511±0.110

3.3 各組大鼠海馬組織病理學觀察（HE染色） 形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組海馬區(qū)細胞核大而圓，核仁明顯，細胞排列整齊；PSD大鼠模型組海馬細胞層層次明顯減少，排列稀疏，細胞核體積變小，深染，結(jié)構(gòu)不清，呈核固縮表現(xiàn)，層次不清；假手術組細胞組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)基本正常；疏腦解郁湯大劑量組及陽性對照組細胞組織數(shù)量、結(jié)構(gòu)及形態(tài)基本恢復正常；疏腦解郁湯中劑量及小劑量組細胞組織數(shù)量、結(jié)構(gòu)及形態(tài)均有不同程度的恢復，但較大劑量組恢復較差。具體見圖1。

圖1　不同組別PSD大鼠腦海馬細胞HE染色（×400）

4 討論

對于PSD的發(fā)病機制的研究，目前沒有十分肯定而清晰的說法，但眾多學者會從以下兩個方面進行解釋［5］：其一為“原發(fā)性內(nèi)源性機制學說”，支持此學說的學者認為腦組織損傷后可能導致的神經(jīng)學和生物學方面的病理變化，很可能是導致PSD的發(fā)生的關鍵因素。受腦組織受損的影響，腦內(nèi)NE、5-HT的濃度及利用率降低，從而導致抑郁癥的發(fā)生。另一方面，很多學者提出“反應性機制學說”，也就是腦卒中患者在發(fā)病以后，其生理及心理平衡狀態(tài)被家庭、生活、周圍環(huán)境等多種因素影響而導致失衡。隨著對本病的不斷研究及深入了解，目前更多的研究者們認為PSD的發(fā)病可能是這兩種發(fā)病機制共同作用的結(jié)果，這兩種發(fā)病機制不能被簡單的孤立看待，他們認為PSD的發(fā)病應該是以腦卒中為前提的，結(jié)合多種影響因素，如心理、社會等共同影響造成的。關于PSD發(fā)病的相關因素，國內(nèi)外學者主要從年齡、性別、認知功能以及神經(jīng)功能缺損程度等多方面著手進行研究，國內(nèi)許多研究［6-7］提出女性比男性更容易發(fā)生抑郁。同時也有少數(shù)研究者［8］認為抑郁的發(fā)病與性別無關。年齡因素也是PSD發(fā)病備受爭議的因素，高政［9］等認為容易發(fā)生抑郁的腦卒中患者年齡一般在40～50歲之間，到60歲開始其發(fā)生率就有所下降了。目前國內(nèi)外學者［8，10-12］普遍認為PSD的發(fā)生與患者神經(jīng)功能缺損程度有著正相關關系，即神經(jīng)功能缺損越嚴重，卒中患者發(fā)生抑郁的可能性越高，抑郁程度也越嚴重。

目前國內(nèi)外對PSD的治療上，由于其的發(fā)病機制還沒明確，所以治療效果不佳。疏腦解郁湯是本人在多年治療卒中后抑郁的臨床經(jīng)驗基礎上，以氣郁血瘀痰阻為本病的重要病機而擬定的以疏肝解郁，理氣活血、化痰寧心為治則的經(jīng)驗方。該方以柴芩溫膽湯、四逆散等為主方加減而成。其中柴芩溫膽湯以疏肝解郁，理氣化痰，四逆散透邪解郁，疏肝理氣，而又加用石菖蒲、遠志、炒棗仁、合歡皮寧心安神、化痰開竅，丹參、川芎以行氣活血。諸藥合用，相輔相成，與西藥相比，不僅安全有效，長期使用毒副作用少，費用低，且展現(xiàn)出良好的治療效果。

Morris水迷宮是標準的研究動物空間學習記憶能力的實驗，可同時檢測動物的空間參考記憶和空間工作記憶，操作方法簡單方便，數(shù)據(jù)反映真實，檢測較靈敏［13］。這種行為測試是對動物空間辨別學習記憶能力進行的，這種能力與動物海馬功能有關。所以水迷宮法在以大鼠海馬為實驗對象的方法中，顯示出更多的優(yōu)越性［14］。該實驗是通過強迫動物游泳的方法，學習尋找水中的安全平臺，來使實驗動物形成較為穩(wěn)定的空間認知，最終反映出實驗動物的學習能力以及記憶能力［14-16］。近年來很多學者也將水迷宮實驗廣泛應用于抑郁證的研究中，以其空間學習能力和認知能力的測定來反映動物抑郁改善情況以及其腦部損傷的恢復情況。

本研究通過對給藥及未給藥的PSD大鼠的學習記憶能力進行觀察，并對每組大鼠海馬組織中單胺類遞質(zhì)含有量進行檢測，著重對大鼠海馬組織及其相關行為學檢測來探討疏腦解郁湯對PSD的治療作用，進一步探究其作用機制。

本研究結(jié)果表明，大劑量疏腦解郁湯能有效提高PSD大鼠學習記憶能力，改善PSD大鼠的抑郁癥狀，其機制可能與其能升高PSD大鼠腦內(nèi)海馬組織中的單胺類遞質(zhì)的含有量有關。

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作者簡介：李寶玲（1968—），女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師。Tel：15934128836，E-mail：dlj_ tz@126.com

收稿日期：2016-03-09

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.040

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1147-04